Plazma Litografi Yüzey Desenlendirme Hücre Ağları Oluşturma

Aşağıdaki deneyin genel amacı, mikro ve nano ölçekli boyutlarda gerçekleşen bireysel ve grup hücre davranışlarıyla ilgili biyolojik soruları incelemek için hücre mikroortamları oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle nihayetinde hücre yerleşimine yön verecek şablonlar tasarlanarak gerçekleştirilir. Ardından, bu tasarımlar fotolitografi aracılığıyla desenli yüzeylere aktarılır; bu da yumuşak litografi yoluyla plazma korumalı kalıpların oluşturulmasına olanak tanır.

Son olarak, bu koruyucu kalıplar bir Petri kabı içerisinde tripod şeklinde düzenlenerek, alttaki yüzeylerin plazmaya seçici olarak maruz kalması sağlanır; bu işlem, her bir kalıbın altındaki alanlarda hücreye duyarlı kimyasal bir desen bırakacaktır. Bir hücrenin davranışının mikroçevresine ve komşu hücrelerle olan etkileşimine nasıl bağlı olduğunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntem, hücre grupları arasındaki etkileşimlerin daha üst düzey fenomenleri nasıl etkilediği gibi, mikroçevrelerin hücre davranışı üzerindeki etkilerine dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Peki, hücre altı nanoölçekli ipuçları sağlıklı migrasyon ve diferansiyasyon gibi fonksiyonları nasıl etkiler? İlk olarak, desenli bir lamı boş lamlardan oluşan bir yığına yapıştırmak için hızlı yapıştırıcı kullanın. Ardından, alüminyum folyodan, lam yığınından biraz daha büyük ve 30 gram polidimetilsiloksan veya PDMS kapasitesine sahip bir kap oluşturun.

Lam yığınını kaba yerleştirin ve başlangıç kalıbını oluşturmak için lam yığınının üzerine PDMS dökün. Ardından, kabı bir vakum odasına yerleştirerek PDMS'deki gazları giderin. Hava akışının kısa süreliğine odaya girmesine izin vermek için giriş valfi hortumunun üzerindeki parmağınızı birkaç kez hızla kaldırıp tekrar kapatarak PDMS içindeki kabarcıkları patlatın.

Kesintisiz gaz giderme işlemi için vana beş dakika boyunca kapalı tutulur. Ardından PDMS'in temiz hava akışlı kabinde, oda sıcaklığında bir ila iki gün boyunca kürlenmesi sağlanır. Kürlenme tamamlandığında, PDMS ana kalıptan soyularak bir kalıp oluşturulur.

Ardından, bir dakika boyunca karıştırılmış altı gramlık iki bileşenli epoksiyi ana kalıba ince bir tabaka halinde dökün. Epoksi donmadan önce, birçok kabarcık kırma döngüsü kullanarak epoksiyi hemen vakumlayarak gazını alın. Gazı alınmış epoksinin bir saat boyunca rahatsız edilmeden bekletilmesinin ardından, epoksi kısmen kürlenmiş olacaktır.

Sonraki adımlarda işlemesi daha kolay, daha kalın bir yapı oluşturmak için vakumlamadan kalıba daha fazla epoksi ekleyin. Ardından epoksinin bir ila iki gün boyunca kürlenmesini bekleyin. Epoksi kalıp kürlendikten sonra, epoksiyi PDMS ana kalıptan çıkarın ve ardından bir kap oluşturmak için epoksi kalıbın etrafını bantla sarın.

Ardından, PDMS'yi epoksi kalıbın üzerine dökerek, PDMS'nin havasını alarak ve yeni kalıbı bir ila iki gün boyunca kürleyerek bir çalışma kalıbı oluşturulabilir. Çalışma kalıbı kürlendikten sonra, kalıbı epoksiden ayırın ve temizliği korumak için her ikisini de akışlı kabin içindeki sızdırmaz bir plastik kapta, Petri kapları içinde saklayın. Yüzey desenleme için bir kalıp hazırlamak amacıyla, çalışma kalıbından jiletle küçük kesitler kesin ve bu kesitleri bir Petri kabına yerleştirin.

Bu kalıp kesitlerinin konumları, kalıp kesitlerinin yerleştiği alanın etrafına bir taslak çizilerek Petri kabının arka yüzeyine kalıcı bir markör ile işaretlenir; kesitlerden bir tripod oluşturun ve çalışma kalıbı ile Petri kabı yüzeyi arasında konformal temasın sağlandığından emin olmak için tripodun oturmasını bekleyin. Çıplak gözle veya küçük bir büyüteçle görülebilen kanalların varlığıyla kanıtlanan uygun yerleşimi doğrulamak için kabın altına bakın. Düzenek plazma odasına yerleştirilir.

Plazma işleminden sonra plazma uygulamasını başlatın. Kalıbı ve ağırlık düzenini kaldırın ve sterilizasyon için Petri kabını bir biyogüvenlik kabini içerisinde 10 dakika boyunca UV ışığı altında bekletin. Kap, hücre ekimi yapılana kadar orada saklayın.

İstenen konfluens düzeyine ulaşmak için seçilen deneysel hücreleri standart kültür ortamlarında seyreltin. Desenli Petri kabı yüzeyine yerleştirildiğinde, Petri kabına üç mililitre hücre solüsyonu dökün. Hücrelerin plazma hücresi tarafından oluşturulan desen üzerinde toplanmalarını sağlamak için desenli Petri kabını 37 °C, %5 karbondioksit ve %100 nem koşullarında birkaç saatten birkaç güne kadar inkübe edin.

Desenleme, faz kontrast mikroskopisi ile kontrol edilir. Nöroblastoma hücreleri kültüre edilirken, hücrelerin nöron benzeri bir duruma farklılaştığı gözlemlenene kadar günlük 10 micromolar retinoik asit ekleyin. Standart hücre kültürü medyasını her üç ila dört günde bir yenileyin.

Plazma litografi tekniğinin uygulanmasının tipik bir sonucu, rastgele veya doğal bir yapıyı andıran bir hücre örüntüsünün oluşmasıdır. Buna bir örnek, çizgi örüntüsü üzerinde retinoik asit ile diferansiye edilmiş nöronların olduğu şu şekilde görülebilir. Çizgilerin ve nöron ağlarının oluşturulduğu şu şekilde ise, nöron dışındaki hücre tiplerinin de kullanılabileceği görülmektedir; sonraki bu iki şekilde, bu şekil insan göbek kordonu ven endotel hücrelerini, bu şekil ise görüldüğü üzere ızgaralar oluşturan C2C12 iskelet kas hücrelerini göstermektedir.

Polilizin gibi materyaller, belirli hücre tiplerinin tutunmasını kolaylaştırmak ve diğer kullanımlar için de desenlenebilir. Bu prosedürün ardından; uyaran kombinasyonlarının hücre davranışlarını ve bireysel hücre davranışlarını nasıl etkilediği gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla mikroakışkanlar, hücre sondalaması veya belirli proteinlerin genetik manipülasyonu gibi ek girdilerin entegrasyonu gerçekleştirilebilir.