JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 3:45 dk • July 8th, 2025
Medial vestibüler çekirdeği veya MVN'yi içeren bir fare beyin sapı dilimi alın.
Nöronal canlılığı korumak için dilimi yapay beyin omurilik sıvısı ile dolu bir kayıt odasına sabitleyin.
MVN nöronlarını bulmak için dilimi mikroskop altında görselleştirin.
Hücre içi ortamı taklit eden bir çözelti ile doldurulmuş bir mikropipeti doku boyunca ilerletmek için pozitif basınç uygulayın.
Pipet bir nörona temas ettiğinde, nöronal zar çukurlaşacaktır.
Küçük bir membran kısmını aspire etmek için negatif basınç uygulayın ve sıkı bir sızdırmazlık oluşturun.
Ardından, zarı yırtmak için negatif basınç darbeleri uygulayın ve nöron ile pipet arasında sürekli bir bağlantı oluşturun.
Nörona rastgele gürültü genlikleri uygulayın ve gürültünün nöronal ateşlemeyi indüklediği bir eşik altı genliği belirleyin.
Son olarak, eşik altı rastgele gürültü genliği ile birlikte nörona bir dizi elektriksel uyaran uygulayın.
Nöronal kazancı ölçün - nöronun, gürültü varlığında uyaranlara ateşleme tepkisini modüle etme yeteneği.
Tüm hücre yama kelepçesi elektrofizyolojisi için, önce potasyum bazlı bir iç çözelti ile doldurulduğunda 3 ila 5 megaohm arasında değişen bir son dirence sahip mikropipetleri çekin ve banyoya yerleştirin. MVN'deki tek tek nöronlardan tam hücre yama kelepçesi kayıtları elde etmek için, tek bir doku dilimini inkübasyon odasından standart bir elektrofizyolojik kurulumun kayıt odasına aktarın ve dilimi sabitlemek için U şeklinde bir ağırlık üzerinde naylon bir iplik kullanın.
Kayıt odasını dakikada üç mililitrelik bir akış hızında 25 santigrat derecede karbojene aCSF ile sürekli olarak perfüze edin ve bir mikropipeti dahili çözelti ile doldurun. Kalıntıları pipet ucundan uzaklaştırmak için bir pipet kullanarak az miktarda pozitif basınç uygulayın. Daha düşük bir güç hedefi kullanarak, MVN içindeki tek tek nöronları bulmak için yüksek bir güce geçmeden önce MVN'yi bulun.
Dokuyu pipetle kırmadan önce, kalıntıları pipet ucundan uzaklaştırmak için az miktarda pozitif basınç uygulayın ve pipeti seçilen nörona doğru hareket ettirmek için mikromanipülatörü kullanın. Nöronal zar üzerinde küçük bir çukur oluşmalıdır. Pozitif basıncı serbest bırakın ve az miktarda negatif basınç uygulayın.
Bir gigaohm'luk bir sızdırmazlık elde edildikten sonra, zarı yırtmak ve tam hücre konfigürasyonu oluşturmak için emme portu aracılığıyla pipet tutucusuna nazik, kısa ve keskin bir negatif basınç uygulayın. Ardından, standart protokollere göre tam hücre akım kelepçesi kayıtları alın.
Bireysel medial vestibüler çekirdek nöronlarına stokastik ve sinüzoidal gürültü uygulamak için, nöronal eşiği ve ateşleme hızını belirlemek için genlik aralığını 3 ila 24 pikoamper arasında ayarlayın ve duyusal eşiği belirlemek için daha düşük ve daha yüksek uyaran yoğunluklarını gruplandırın.
Ardından, her bir akım seviyesi için depolarize edici akım adımının enjekte edileceği 10 saniyelik süre boyunca ortalama ateşleme hızını hesaplayın. Mevcut grafiğe karşı bir ateşleme hızı oluşturmak için ortalama ateşleme hızı değerlerini kullanın. Ardından, nöronal kazancı belirlemek için en uygun çizginin gradyanını belirlemek için doğrusal bir regresyon analizi yapın.