JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 2:57 dk • July 8th, 2025
Kaplanmış lameller üzerinde kültürlenmiş zebra balığı retinal ganglion hücrelerini alın.
Bu hücreler, hidrojen peroksite duyarlı bir enzim olan Orp1'e kaynaşmış redoksa duyarlı yeşil floresan proteini roGFP2'yi üreten genetik olarak kodlanmış bir biyosensörü ifade eder.
Lameli ortamla birlikte canlı bir hücre görüntüleme odasına aktarın ve odayı ters çevrilmiş bir mikroskop üzerine yerleştirin.
Arka plan floresansını azaltmak için ortamı serumsuz ortamla değiştirin.
Düşük hidrojen peroksit seviyeleri nedeniyle, roGFP2 azaltılmış konformasyonunda kalır.
Biyosensörü 405 ve 480 nm dalga boylarında sırayla uyarın.
İndirgenmiş roGFP2, 480 nm'de bir uyarma zirvesi sergiler.
Hidrojen peroksit içeren bir ortama geçin.
Hidrojen peroksit hücrelere girer ve Orp1 ile reaksiyona girerek roGFP2'yi oksitler.
Biyosensörü tekrar heyecanlandırın.
Oksitlenmiş roGFP2, 405 nm'de bir floresan artışı ve 480 nm'de bir azalma sergiler.
Floresan yoğunluk oranını hesaplayın.
Orandaki bir artış, hücresel hidrojen peroksit seviyelerinin arttığını gösterir.
Görüntüleme gününde, RGC aksonlarının büyümesini doğrulamak için mikroskop altında hücreleri kontrol edin. Canlı hücre görüntüleme için, lamelleri kültür kabından bir canlı hücre görüntüleme odasına aktarın. DIC objektif, OG590 uzun geçişli kırmızı filtre ve EM-CCD kamera ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın.
Görüntülemeden önce ZFCM+ ortamını ZFCM- ile değiştirin. Hücreleri 10x objektifle konumlandırdıktan sonra, yağa daldırma objektifi kullanarak 60x büyütmede görüntüler elde edin. Ek bir 1,5x büyütme kullanın.
Önce DIC görüntülerini, ardından uygun bir filtre seti kullanarak görüntü roGFP2-Orp1'i alın. İlk görüntü setini çektikten sonra, medyayı farklı tedavi solüsyonları içeren medyayla değiştirin. pH ve ozmolarite değişikliklerini önlemek için ortam her 30 dakikada bir değiştirilmelidir.