JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 4:21 dk • July 8th, 2025
İki ayrı bölgeye yerleştirilmiş birlikte kültürlenmiş embriyonik omurilik dilimleri ile polimer kaplı çok elektrotlu bir dizi veya MEA alın ve her iki dilimden aynı anda kayıt yapılmasına izin verin.
Dilim, daha önce lezyonlu alanda rejenere nöral bağlantıları gösterir.
MEA'yı, nöronal sağkalımı sürdürmek için iyonlar ve besinler açısından zengin hücre dışı bir çözelti içeren bir kayıt odasına yerleştirin.
Sistemin stabilize olmasına izin verin, nöron adaptasyonunu ve iletişimini kolaylaştırın.
Nöronlar, MEA'daki yakındaki elektrotlar tarafından kaydedilen aksiyon potansiyelleri adı verilen elektrik sinyalleri aracılığıyla iletişim kurar.
Her elektrottan gelen ayrı sinyaller birleştirilir ve her dilimden bir elektrik sinyali üretilir.
Nöron stabilitesini korumak için hücre dışı çözeltiyi düzenli olarak değiştirin.
Nöronal membranlar üzerindeki inhibitör nörotransmitter reseptörlerini bloke eden ve nöronları daha uzun süre aktif tutan inhibitörlerle hücre dışı bir çözelti ekleyin.
Her iki dilimdeki elektriksel aktiviteyi karşılaştırın. İki dilim arasındaki senkronize bir elektrik sinyali, sinaptik bağlantıları ve başarılı nöral rejenerasyonu doğrular.
Stereomikroskop altında içine kaplanmış bir mikroelektrot dizisi olan bir Petri kabı koyun. Diziyi odağa getirin ve altı mikrolitrelik bir tavuk plazma damlacığını elektrot dizisi üzerinde ortalayın. Küçük bir spatula kullanarak, iki omurilik bölümünü, ventral tarafları birbirine bakacak şekilde plazma damlacıkına dikkatlice kaydırın.
Daha sonra, tavuk plazma damlacığının etrafına sekiz mikrolitre trombin ekleyin. Ardından, tavuk plazması ve trombin karışımını dikkatlice karıştırmak ve yaymak için pipet ucunu kullanın. Tavuk plazması ve trombin karışımı çok lifli hale gelmeden ve pıhtılaşmaya başlamadan hemen önce, fazla sıvıyı aspire edin. Ardından, Petri kabının kapağını kapatın ve nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin.
Odayı yaklaşık bir saat boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatörün içine yerleştirin. İnkübasyondan sonra, numuneye dikkatlice 10 mikrolitre besleyici ortam ekleyin. Petri kabını kapatın ve 45 dakika daha inkübatöre geri koyun. Daha sonra, çok elektrotlu dizi kültür düzeneklerinin her birini bir silindir tüpüne yerleştirin ve üç mililitre besin ortamı ekleyin. Kapağı sıkıca kapatın ve silindir borusunu silindir tamburuna yerleştirin. Tamburu inkübatörde 37 santigrat derecede 1 ila 2 RPM'de döndürün.
Steril kauçuk uçlu forseps kullanarak, çok elektrotlu dizi kültür düzeneklerini silindir tüpünden çıkarın ve bunları bir stereomikroskop altında bir Petri kabına yerleştirin. Dokuyu odak noktasına getirin ve iki dilimin kaynaştığını doğrulayın. Ardından, düzeneği sabit tutun ve çoklu elektrot dizisinin oluğuna doku dilimlerine yakın bir neşter bıçağı yerleştirin. Neşteri oldukça yatay bir şekilde tutun ve ardından neşter sapını yukarı kaldırın, ancak neşter bıçağının, bıçağın tabandan uca yuvarlanacağı, dokuyu keserek oluğu kaplayacak şekilde dizinin oluğunda kalmasına izin verin.
Gerekirse 25 gauge iğne ucuyla kalan doku bağlantılarını kesin. Yalnızca oluk içindeki alanda çalışın ve hassas kenarlara dokunmayın. Çok elektrotlu dizi kültür düzeneklerini silindir tüpüne geri koyun ve kültürlere üç mililitre taze besin ortamı ekleyin. Ardından, silindir tüpünü 37 santigrat derecede inkübatördeki silindir tamburuna geri yerleştirin.
Çok elektrotlu bir dizi kültür düzeneğini bir kayıt odasına monte edin ve diziye yaklaşık 500 mikrolitre hücre dışı çözelti uygulayın. Ardından, düzeneği mikroskobun üzerine monte edin. Sistemin stabilize olması için 10 dakika bekleyin ve ardından aktivite tespit eden elektrotların her birinden 10 dakika boyunca temel spontan aktiviteyi kaydedin. Kayıtları toplam iki kez tekrarlayın.
Kararlı hücre dışı koşulları sağlamak için, her kayıt oturumundan sonra hücre dışı çözeltiyi değiştirin. İstenirse, bir mikromolar striknin ve 10 mikromolar gabazin içeren hücre dışı çözelti uygulayarak ağı inhibe edin ve elektriksel aktiviteyi kaydetmeden önce en az iki dakika bekleyin.