JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 3:01 dk. • July 8th, 2025
Bir agar bloğunda büyüyen transgenik Caenorhabditis elegans solucanlarını ele alalım.
Bu solucanlar, yumurtlama davranışını düzenleyen nöronlarda bir kalsiyum indikatörü olan GCaMP5 ve kalsiyuma duyarsız bir floresan proteini olan mCherry'yi eksprese eder.
Solucanları ters çevrilmiş bir mikroskop aşamasına monte edin.
GCaMP5 ve mCherry floresansını görselleştirin.
Yumurta salınımından önce, nöronlar aktive olur ve kalsiyum akışına izin veren voltaj kapılı kalsiyum kanallarını açar.
Hücre içi kalsiyum, GCaMP5'e bağlanarak konformasyonunu değiştirir ve floresansını arttırır.
Bu arada, mCherry floresansı değişmeden kalır ve nöronun izlenmesini sağlar.
Aktive edilmiş nöronlar, belirli kas reseptörlerine bağlanan nörotransmiterleri serbest bırakarak yumurta salınımını tetikler.
Serbest bırakıldıktan sonra, kalsiyum kanalları kapanır, kalsiyum akışını ve GCaMP5 floresansını azaltır.
Ardından, solucan hareketini gözlemlemek için parlak alan görüntüleri yakalayın.
Yumurta bırakmadan önce kas kasılmaları nedeniyle hareketin azalması meydana gelir.
Yumurta salınımını takiben, kaslar gevşer ve normal hareketi geri kazandırır.
Yumurta salınımı olaylarını tespit etmek için GCaMP5-mCherry floresan oranını ve solucan hızını ölçün.
Oransal kalsiyum görüntüleme için, Sıra sekmesi altında, kayda başlamak için Başlat'a tıklayın ve solucanı joystick ile takip edin, ilgilenilen hücreleri ve sinapsları görüş alanının merkezinde odakta tutun. Floresan kaydı başlatıldığı anda, senkronize görüntüleri ve sahne konumunu toplamaya başlayan bekleyen parlak alan kamerasına ve sahne kontrolörüne tetikleyiciler gönderilir.
Her kanalın piksel istatistiklerini göstermek için histogram penceresindeki İstatistikler düğmesine tıklayın. LED gücünü, kırmızı kanalda 8.000 sayıma eşit veya daha büyük presinaptik terminalde maksimum tek pikselli mCherry floresan sağlayacak şekilde ayarlayın ve arka planın üzerinde yaklaşık 12 bit dinamik aralık verin. Dinlenme sırasında presinaptik terminaldeki kalsiyum raportör sinyalleri veya düşük kalsiyum, yeşil kanalda yaklaşık 2.500 sayım olmalıdır.
Bir yumurtlama etkin durumuna ulaşılana kadar davranışı kaydedin. Ardından, ilk yumurtlama olayından önce 6.000 kare ve sonra 6.001 kare içeren 10 dakikalık bir alt küme kaydedin. Solucan davranışının parlak alan görüntülerinin aynı alt kümesini ve x,y aşaması konumunun zaman noktalarını tutmaya dikkat edin, aksi takdirde veri akışlarının kesin senkronizasyonu kaybolur.