Aksonal Varislerin Nöronlar Üzerinde Mikromekanik Bir Uyaran ile İndüklenmesi

Bir mikromanipülatöre bağlı hortumlu bir mikropipeti sabitleyerek başlayın.

Borunun diğer ucunu, döndürülebilir valfli bir konektör aracılığıyla tuz tamponu ile doldurulmuş bir şırıngaya takın.

Şırıngayı, aksonlarda varisleri indüklemek için yeterli basıncı sağlayan bir yüksekliğe ayarlayın.

Aksonal varisler, bir aksonun uzunluğu boyunca meydana gelen boncuk benzeri şişliklerdir.

Mikropipeti kültür kabına göre istenen açıda konumlandırın.

Mikropipet ucunu hizalamak için mikroskoptan gelen floresan ışığı kullanın ve tuz tamponu içeren hücre kültürü kabının yüzeyine yakın bir yere indirin.

Şimdi, iletilen ışığı açın ve floresan filtreyi kapatın.

Tabağın üzerine nöronlu bir lamel yerleştirin.

İlk olarak, mikropipete odaklanın ve konumunu ayarlayın.

Ardından, hedef nöronları içeren bölgeye odaklanın.

Sıvı basıncı uygulamak için valfi açın. Bu mikromekanik uyaran, bu nöronlarda varislere neden olur.

Bu prosedürde, pipeti yerinde tutmak için mikromanipülatörün vidalı üst kısmına yerleştirin. Pipeti, yüzeyi hücre kültürü kabına 45 derecelik bir açıyla açın. Floresan filtresini açın. Diyaframı açın ve objektiften gelen floresan bir noktanın görülebildiğinden emin olun.

Mikromanipülatörü kullanarak, pipeti, ucu floresan nokta ile aynı hizaya getirecek bir konuma getirin ve pipeti, hücre kültürü kabının yüksekliğinin hemen üzerinde bir konuma indirin. Yerine oturduğunda, iletilen ışığı açın ve floresansı kapatın. Cımbız kullanarak, hücreler pipete bakacak şekilde bir lamel hücre kültürü plakasından oda sıcaklığında 2 mililitre Hank tamponu içeren hücre kültürü kabına aktarın.

İnce netleme düğmesini ve 20 katlı objektifi kullanarak, hücrelerin yaklaşık dört tam tur üzerindeki bir düzleme odaklanın. Ardından, pipet ucunu, göz merceklerinden görüldüğü gibi odaklanacak ve düzlemin sol orta tarafında olacak şekilde konumlandırmak için mikromanipülatörü kullanın. Pipet yerine oturduktan sonra, mikroskobu ilgilenilen bölgeyi içeren bir düzleme odaklayın.

7DIV'in görüntülenmesinde, GFP transfekte edilmiş fare hipokampal nöronları, şişirme öncesi ve sonrası bir akson gösterdi.