JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 5:10 dk. • July 8th, 2025
Genetik olarak tasarlanmış zebra balığı embriyolarını stereomikroskop altına yerleştirin ve omurilik motor nöronları tarafından tetiklenen spontan kuyruk kıvrılmasını gözlemleyin.
Bu nöronların içsel özellikleri, sodyum kanallarından iyon akışına neden olur, bu da spontan membran depolarizasyonuna ve kaslara yayılan ve kuyruk sargısını tetikleyen aksiyon potansiyellerinin oluşmasına yol açar. Sarma frekansını ölçün.
Sodyum akışını engellemek ve azaltılmış sarma frekansını değerlendirmek için bazı embriyoları bir sodyum kanal blokerine aktarın.
Tedavi edilmemiş embriyoları erimiş agaroza monte edin; hareketi kısıtlamak için agarozun katılaşmasına izin verin ve bir floresan mikroskobu altında gözlemleyin.
Motor nöronlar, donör ve alıcı floroforlara kaynaşmış, zara bağlı voltaj algılama alanına veya VSD'ye sahip bir biyosensörü ifade eder.
Depolarizasyon, VSD konformasyonunu değiştirerek floroforları daha yakın hale getirir.
Uyarılma üzerine, verici enerjiyi alıcıya aktarır ve alıcının floresan emisyonuna neden olur.
Depolarizasyonu inhibe etmek için blokeri ekleyin, bu da alıcı emisyonunu azaltır ve nöronlarda spontan depolarizasyonun bloker aracılı inhibisyonunu doğrular.
Spontan kuyruk sarma analizi için, embriyoları% 0.2 DMSO içeren balık suyu ile doldurulmuş 90 milimetrelik yuvarlak bir Petri kabına aktarın ve keskin uçlara veya iğnelere sahip iki kuyumcu forseps kullanarak manuel olarak dekoryonlayın. Daha sonra embriyoları 28 santigrat derecede 5 dakika inkübe edin. Stereomikroskop üzerine monte edilmiş bir dijital kamera kullanarak, bir dakikalık video kaydı sırasında oda sıcaklığında kuyruk sargısını tespit edin.
Ardından, zaman serisini saniyede 30 karelik bir zaman çözünürlüğünde elde edin. Ardından, zaman birimi başına bükülme sayısını sayarak spontan kuyruk sarma sıklığını hesaplayın. Riluzol ilacının etkisini değerlendirmek için, embriyoları 5 mikromolar riluzol içeren balık suyuyla doldurulmuş 90 milimetrelik yeni bir Petri kabına aktarın. Ardından, bir dakikalık bir video kaydetmeden ve davranış analizini gerçekleştirmeden önce embriyoları 28 santigrat derecede 5 dakika inkübe edin.
Şimdi, 20 ila 24 hpf embriyosunu, 37 santigrat derecede 35 milimetre cam tabanlı bir görüntüleme kabının içindeki balık suyunda% 1 düşük erime noktalı agaroza monte edin. Embriyoları yanlarına doğru yönlendirin ve agaroz oda sıcaklığında katılaşana kadar bekleyin.
Daha sonra, görüntüleme çanağını konfokal mikroskop aşamasına aktarın. 488 nanometre argon lazer ile heyecan verici monomerik Umikinoko-Green ile biyosensörü ifade eden motor nöronları tanımlayın. Ardından, emisyonunu 495 ile 525 nanometre arasında ayarlayın ve Rekor'a basın.
FRET ölçümü için, FRET çiftinin donörü olan mUKG'yi 488 nanometre lazerle uyarın. Eşzamanlı olarak, iki fotoçoğaltıcı kullanarak, donör tarafından yayılan floresanı ve monomerik Kusabira-Orange alıcısı tarafından yayılan floresansı tespit edin. Deneyin başında, mUKG floresansının kaydedildiği fotoçoğaltıcı 1'in kazancını ve ofsetini optimize edin ve bunları oturum boyunca sabit tutun.
Uzaklığı ayarlamak için, Q arama tablosunu kullanarak görüntünün rengini yoğunluk değerlerine değiştirin. Lazer kapalıyken tarama yaparken, arka plan piksellerinin yoğunluğu sıfırdan biraz daha yüksek olacak şekilde ofset kaydırıcısını kullanın. Aynı arama tablosunu kullanarak lazeri açın. Tarama sırasında, doygun piksellerden kaçınmaya dikkat ederek sinyal-gürültü oranını en üst düzeye çıkarmak için kazanç kaydırıcısını kullanın.
Yazılım edinme penceresinde, açılır menüden xyt alma modunu ve 512x64 piksellik bir görüntü alanı boyutunu seçin. Ardından, embriyo spinal nöron voltajındaki değişikliklerin kaydını, bir dakika boyunca her 30 milisaniyede bir tek bir xy düzlemi elde edecek şekilde ayarlayın. Riluzol uygulamasının aynı nörondaki membran depolarizasyonu üzerindeki etkisini değerlendirin, 5 mikromolar riluzol içeren balık suyunun eklenmesinden beş dakika sonra yeni bir veri seti elde edin.