JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 4:06 dk • July 8th, 2025
Bir elektrofizyoloji kurulumunda hücre dışı bir çözelti ile doldurulmuş bir kayıt odasında hareketsizleştirilmiş, felçli bir zebra balığı larvası ile başlayın.
Afferent bir mikropipeti, nöronal aktiviteyi kaydetmek için elektriksel iletkenlik sağlayan iyonlar içeren hücre dışı çözelti ile doldurun.
Sinyal kaydı için bir amplifikatöre bağlı bir kayıt elektrodu içeren bir mikromanipülatöre monte edin.
Pipetin tıkanmasını önlemek için pozitif hava basıncı uygulayın.
Pipet ucunu lateral çizgi siniri boyunca hareket ettirin ve bir dizi afferent nöronal hücre gövdesi içeren afferent ganglionun yanına yerleştirin.
Bu nöronların hücresel süreçleri, su hareketlerini algılayan yanal çizgi boyunca yer alan saç hücrelerine bağlanır.
Ardından, mikropipet ile afferent ganglion arasında gevşek bir sızdırmazlık oluşturmak için hafif negatif basınç uygulayın.
İmmobilize larvadaki tüy hücrelerinden duyusal girdiyi alan afferent nöronlardan gelen elektrik sinyallerini kaydedin.
Zebra balığı larvalarını hareketsiz hale getirin ve büyük uçlu bir transfer pipeti kullanarak 35 milimetrelik bir petri kabına aktarın. Çevredeki çözeltiyi mümkün olduğunca çıkarın. Larvaları yaklaşık beş dakika boyunca 10 mikrolitre% 0.1 alfa bungarotoksine daldırın. Felçli larvaları hücre dışı çözelti ile 10 dakika yıkayın. Ardından, larvaları hücre dışı solüsyon banyosundan silikon tabanlı kayıt kabına taşımak için bir transfer pipeti kullanın.
Stereomikroskop altında, larvaları ince uçlu forsepslerle silikon matın merkezinin üzerine, vücudun ön ve arka uçları soldan sağa bakacak şekilde yan tarafı yukarı bakacak şekilde nazikçe yerleştirin. İnce uçlu forseps kullanarak, kazınmış pimi larvaların dorsal notokordundan silikona ortogonal olarak, doğrudan anüsün dorsaline yerleştirin. İkinci pimi kuyruğun ucuna yakın notokorddan geçirin ve üçüncü pimi gaz kesesinin notokord dorsalinden geçirin. Pim kapsülleyiciye girerken hafif bir dönüş sağlarken dördüncü pimi otik vezikülden geçirin.
Hafif bir rotasyon uygulanırken, afferent somata kümesini ortaya çıkarmak için kleithrum ve otik vezikül arasındaki dokuyu izleyin. Sabitlenmiş lavı DIC mikroskobunun sabit bir aşamasına 10 kez objektifin altına yerleştirin ve kas bloklarının miyoseptal yarıklarını sol kafa aşaması vektörüne paralel olarak yönlendirin.
Topraklama kablosunu banyo solüsyonuna yerleştirin ve sol kafa aşamasına bağlı olduğundan emin olun. Afferent kayıt elektrodunu 30 mikrolitre hücre dışı solüsyonla doldurun ve sağ kafa aşaması pipet tutucusuna yerleştirin. Ardından, pnömatik bir dönüştürücü tarafından üretilen pozitif basıncı uygularken çanak çözeltisine indirin.
Elektrodu bulun ve elektrot ucunu numunenin üzerine getirin. Bir mikromanipülatör kullanarak, afferent elektrot ucunu, kleitrumun üzerinde tutma pozisyonuna gelene kadar indirin. Büyütmeyi 40 kat daldırmaya yükseltin ve posterior lateral çizgi, sinir ve kleitrumun kesişimini bulun. Elektrot ucunu afferent ganglionun üzerine getirin ve uç epitele temas edene kadar pipeti indirin. Elektrotu nazikçe, tüm uç çevresi afferent ganglion ile temas edecek şekilde hareket ettirin.