JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 4:08 dk. • July 8th, 2025
Bir perfüzyon odasında bir ağ ızgarası üzerinde havalandırılmış bir yapay beyin omurilik sıvısı veya aCSF'yi perfüze ederek başlayın.
Floresan protein eksprese eden nöronlar içeren bir beyin dilimini aktarın ve platin telli bir cihazla sabitleyin.
Hizalama için kafes ızgarasını döndürün.
Çok kanallı probu dilime doğru indirin.
Floresan protein görselleştirmesi için filtre küpünü ayarlayın.
Probu hizalamak için dilimi döndürün.
Doku yüzeyinin altındaki prob yüksekliğini ayarlayın.
Şimdi, aCSF'yi perfüze edin ve floresan olarak işaretlenmiş nöronlara odaklanın.
Yüksek güçlü bir objektif kullanarak dokuya odaklanın ve uyarma ışığını ayarlayın.
Nöronlardaki floresansı gözlemlemek için uygun bir ışık filtresi kullanın.
Yama pipeti için alan yaratmak ve pozitif basınç uygulamak için objektif lensi ayarlayın.
Ardından, bir zar çukuru oluşturmak için pipeti nöronun yakınına yerleştirin.
Son olarak, bir zar sızdırmazlığı oluşturmak için zayıf emme uygulayın, ardından zarı kırmak ve hedeflenen nörondan elektrik kayıtları elde etmek için güçlü emme uygulayın.
Çok kanallı probu ex vivo beyin dokusu slaytına yerleştirmek için, kabarcıklı deneysel ACSF'yi dakikada üç ila altı mililitre perfüze edin ve ilgilenilen alanı içeren beyin dilimini mikroskop perfüzyon odasındaki ağ ızgarasına aktarın. Beyin dilimini platin bir arp ile sabitleyin. Ağ ızgarasını, çok kanallı probun distal ucundaki elektrot temas hattı PL yüzeyine yaklaşık olarak dik olacak şekilde döndürün.
Geniş alan aydınlatması ve mikromanipülatörün hassas kontrolü altında, çok kanallı probu dilimin yüzeyine doğru indirin. Kortikal afferentlerin akson terminallerinde eksprese edilen floresan raportör proteinin görselleştirilmesi için uygun filtre küpünü devreye sokun.
Gerekirse, probu PL yüzeyiyle daha hassas bir şekilde hizalamak için dilimi döndürün. Probu, dilim düzleminin hemen üzerine, x ekseni boyunca nihai hedef konumdan 200 mikrometre kısa olacak ve kaydedilecek doku alanının dışında en az bir kanal bırakacak şekilde konumlandırın. Yavaşça, probu uzunlamasına ekseni boyunca dilime yerleştirin.
Dokuya verilen hasarı en aza indirmek için, probu yalnızca keskin uçlar doku yüzeyinin hemen altında görülebilecek kadar ilerletin. Deneysel ACSF kaynağını torbalı kontrol çözeltisine geçirin ve hedeflenen yama kelepçesi kaydı için floresan etiketli hücreyi tanımlayın. Diyaframı en küçük çapla sınırlayın ve çok kanallı prob ile objektif lens arasındaki teması önlemek için yüksek güçlü suya daldırma objektifini devreye sokun. Dokuyu odak noktasına getirin.
Işığı, çok kanallı proba bitişik, ancak onunla örtüşmeyen bir doku alanı üzerinde ortalayın. Cre'ye bağlı floresan işaretleyiciyi ifade eden hücrelerin görüntülenmesine izin vermek için uygun filtre setini kullanın. Bir yama pipetini indirmek için geniş alan yaratmak için objektif lensi kaldırın.
Dahili solüsyon içeren ve elektrot tutucusuna monte edilmiş bir yama pipeti yükleyin. Yaklaşık 0,1 mililitre havaya karşılık gelen pozitif basınç uygulamak için bir mililitrelik bir şırınga kullanın. Yama pipetini çözeltinin içine indirin, ucu görsel rehberlik altında odak noktasına getirin ve hedeflenen hücreden tam hücre kaydı elde edin.