Tüm Hücre Yama Kelepçesi Kullanarak Kisspeptin Nöronları Üzerinde Test Büyüme Hormonu Etkisinin Belirlenmesi

Transgenik bir fare hipotalamik dilimini aCSF ile perfüze edilmiş bir kayıt odasına sabitleyin.

Dilim, üreme sistemi regülasyonu için çok önemli olan floresan füzyon proteini eksprese eden kisspeptin nöronları içerir.

Dahili bir çözeltide bir kayıt elektrodu içeren bir mikropipet monte edin.

Mikroskobik olarak bir floresan kisspeptin nöronunu bulun.

Pipete pozitif basınç uygulayın ve hedef nörona doğru ilerletin. Temas halinde, basınç nöronal zar üzerinde bir girinti oluşturur.

Mikropipet ile membran arasında yüksek dirençli bir conta oluşturarak kısa bir negatif basınç uygulayın.

Doğru ölçümler için tutma voltajını nöronun fizyolojik dinlenme potansiyeline ayarlayın.

Zarı kırmak için kısa negatif basınç darbeleri uygulayın ve tüm hücre konfigürasyonu oluşturun.

Parametreleri izleyerek nöronun canlılığını onaylayın.

Sinyal yollarını tetikleyen ve nöronun zar potansiyelinde değişikliklere neden olan bir test büyüme hormonu tanıtın.

Büyüme hormonunun nöronal aktivite üzerindeki inhibitör etkisini belirlemek için zar potansiyelindeki değişiklikleri ölçün.

İlgilendiğiniz bir beyin dilimini akrilik bir transfer pipeti kullanarak kayıt odasına teker teker aktarın. Dilimi, aCSF perfüzyonu sırasında hareket etmemesi için bir dilim ankrajı ile tutun. Daldırma mikroskobunun düşük güçlü objektif lensini 10x veya 20x kullanarak dilimi kayıt odasının ortasına yerleştirin.

Dilim konumu, mikroskop altında istenen bölgenin iyi bir şekilde görülebilmesi ve kayıt mikropipetine mükemmel bir erişim sağlanması için kritik öneme sahiptir. İlgilenilen bölgeyi bulduktan sonra, objektif lensi 63x yüksek güçlü lense geçirin ve doku seviyesine odaklanın, endojen floresan proteini ve hedef bölgedeki hücrelerin şekillerini gözlemleyerek kisspeptin hücrelerini bulmak için beyin diliminin yüzeyinde.

Olası bir hedef hücre bulunduğunda, bunu bilgisayar ekranında fare imleci ile veya ilgilenilen alanın üzerine kare gibi bir format çizerek işaretleyin. İşaretlenen bilgisayar ekranı, kayıt mikropipetinin konumunu hücreye yönlendirmeye yardımcı olur. Hedef hücrenin tam yerini belirledikten sonra, hedefi kaldırın ve dahili solüsyonla doldurulmuş kayıt mikropipetini elektrot tutucusuna sokun ve dahili solüsyonun gümüş elektrotla temas halinde olduğundan emin olun.

Mikropipete girmesini önlemek için bir polietilen boru aracılığıyla mikropipet tutucusuna bağlanan 1 ila 3 mililitrelik hava dolu bir şırınga kullanarak mikropipeti aCSF çözeltisine daldırmadan önce pozitif bir basınç uygulayın. Mikro manipülatörü kullanarak, mikropipeti objektifin merkezinin altına yönlendirin. Mikropipetin x, y, z eksenini ilgilenilen hücreye doğru yönlendirmek için mikro manipülatör düğmelerini hareket ettirin.

Mikropipetin ucunu görmek için odağı ayarlayın ve odağı dilime çok yaklaştırmayın. Mikro manipülatörün hızını azaltın ve mikropipeti yavaşça odak düzlemine indirin, böylece mikropipet ucunun dilime aniden nüfuz etmediğinden, ancak hücre yüzeyine veya hedef bölgeye temas edene kadar yavaşça alçaldığından emin olun.

Yaklaşma yolundaki kalıntıları temizlemek için 1 ila 3 mililitre hava dolu şırınga ile hafif pozitif basınç uygulayarak, mikropipet ucunu yaklaştırmak ve hedef hücreye dokunmak için mikro manipülatörü x, y, z ekseni üzerinde yavaşça hareket ettirin, bu da uygulanan basınçla çukurlaşmaya neden olur. Çukuru kurduktan sonra, yazılım üzerindeki voltaj kelepçesi modu yardımıyla, mikropipet ile hücre arasındaki sızdırmazlığı oluşturmak için mikropipet tutucusuna bağlı tüp boyunca 1 ila 2 saniye boyunca ağızdan zayıf kısa emme uygulayın.

Conta, yaklaşık bir dakika boyunca gürültü paraziti olmadan mekanik olarak sabit kalırsa, tutma voltajını ilgili hücrenin en yakın fizyolojik dinlenme potansiyeline ayarlayın. Kisspeptin hipotalamik nöronlar için eksi 50 milivolt önerilir. Daha sonra, yırtılan zarın mikropipeti tıkamaması veya büyük bir zar kısmını veya hücreyi çekmemesi için hücreye yerleştirilen mikropipet ucundaki plazma zarını kırmak için ağızdan kısa bir emme uygulayın.

Yeterli kuvvetle emme yapılarak yeterli bir tüm hücre konfigürasyonu elde edilebilir. Kullanılan sistem ayarları kılavuzunu kontrol edin. Hücre zarını kırdıktan sonra, voltaj kelepçesi modunda Tüm Hücre seçeneğini etkinleştirin ve Tüm Hücre sekmesine atıfta bulunan otomatik komuta tıklayın.

Ardından, metin el yazmasında açıklandığı gibi yazılımdaki hücre canlılığı parametrelerini kontrol edin. Deneyler sırasında serinin direncini ve hücrelerin kararlı durum kapasitansını izleyin. Tüm hücre konfigürasyonu düzgün bir şekilde elde edildikten sonra, voltaj kelepçesi modunda sinaptik akımları ölçün. Mevcut kelepçe modunda dinlenme membran potansiyelindeki değişiklikleri ve indüklenen dinlenme membranı potansiyeli değişimlerini kaydedin.