Bir Fare Beyin Diliminde Yeniden Programlanmış Nöronların Elektrofizyolojik Kayıtları

Oksijenli tampon ile perfüze edilmiş bir kayıt odasında hareketsiz hale getirilmiş, genetik olarak tasarlanmış bir fare koronal dilimi alın.

Dilim, bir internöron markörü ve floresan protein ekspresyonu ile işaretlenmiş oligodendrosit öncü hücrelerinden yeniden programlanmış internöronlara sahip striatal bölgeyi içerir.

Hücre içi bir çözeltiye batırılmış bir elektrottan oluşan bir kayıt pipeti monte edin.

Mikroskobik olarak bir floresan internöronu tanımlayın.

Pipette pozitif bir basınç sağlayın ve zarla temas ederek hedef internörona doğru ilerletin.

Yüksek dirençli bir conta oluşturmak için negatif basınç uygulayın.

Zarı kırmak için negatif basınç darbeleri uygulayın ve tam hücre konfigürasyonu oluşturun.

İnternöronun zar potansiyelini sabit bir negatif değerde tutun.

Kısa artımlı akımlar uygulayın, iyon kanallarını açın ve membran potansiyelini değiştirin, bir aksiyon potansiyelini tetikleyin.

Sonunda, zar dinlenme potansiyeline geri döner.

Mevcut enjeksiyona yanıt olarak membran potansiyelindeki bu değişiklikleri gözlemleyin, bu da nöronal olgunlaşmayı ve başarılı yeniden programlamayı gösterir.

Bir doku bölümünü elektrofizyoloji için bir kayıt odasına aktardıktan sonra, cam pipeti kayıt elektroduna monte edin ve çözeltiye indirin. Elektrotun direncini iki kez kontrol edin. Ardından, pipetle yeniden programlanmış hücreye yavaşça yaklaşın, ucun tıkanmasını önlemek için elektrotta hafif bir pozitif basınç tutun ve yama yapmadan önce hücrenin GFP pozitif olduğunu kontrol edin.

Hücre yamalandığında, hücreyi eksi 60 ila eksi 70 milivolt arasında akım kelepçesinde tutun ve aksiyon potansiyellerini indüklemek için 10 pikoamper artışlarla eksi 20 ila artı 90 pikoamper arasında 500 milisaniyelik akımlar enjekte edin. Bu, nöronal olgunlaşmanın ve başarılı bir yeniden programlamanın göstergesidir.