Bir omurilik diliminin substantia jelatinosa nöronunda tam hücre yama kelepçesi kaydı

Bir sıçan omurilik dilimini bir kayıt odasına yerleştirin ve bir doku ankrajı ile sabitleyin.

Dilimi yapay beyin omurilik sıvısı ile perfüze edin.

Mikroskop altında, yarı saydam substantia gelatinosa veya SG bölgesini tanımlayın ve sağlıklı bir SG nöronu seçin.

Nöronun yakınına iyonik bir çözelti ile doldurulmuş bir yama pipeti yerleştirin.

Pipet ucundaki kalıntıları temizlemek için hafif pozitif basınç uygulayın.

Pipeti nörona doğru hareket ettirin.

Ardından, nöronal zar üzerinde bir çukur oluşturmak için pozitif basıncı serbest bırakın ve bir sızdırmazlık oluşturun.

Dinlenme membran potansiyeline veya RMP'ye yaklaştırmak için tutma potansiyelini değiştirin.

Zarı yırtmak için kısa bir emme kullanın ve tam hücre konfigürasyonu oluşturun.

RMP'de depolarize edici elektrik darbeleri uygulayın.

Bu darbeler, voltaj kapılı sodyum kanallarını açarak hızlı bir sodyum iyonu akışına izin verir.

Bu iyon akışı, nöronun ateşlenmesine neden olan bir aksiyon potansiyelini tetikler.

Nöron ateşleme modellerini kaydedin.

Substantia gelatinosa veya SG nöronlarından tam hücre yama kelepçesi kayıtları yapmak için, kayıt için potasyum iyon bazlı hücre içi solüsyonlar kullanırken, sadece inhibitör postsinaptik akımların kaydı için sezyum katyon bazlı solüsyon uygulayın.

Omurilik dilimini nazikçe kayıt odasına taşıyın ve ardından optimum dilim stabilitesi için naylon ipliklere sahip u şeklinde bir platin tel ile sıkıca sabitleyin. Dilimi oda sıcaklığında kabarcıklı ACSF ile sabit bir şekilde perfüze edin ve yeterli oksijenasyonu elde etmek için perfüzyon hızını dakikada 2 ila 4 mililitre olarak ayarlayın.

Ardından, düşük çözünürlüklü bir mikroskop lensi kullanarak, SG nöronlarının bölgesini yarı saydam bir bant olarak tanımlayın. Yüksek çözünürlüklü objektifi kullanarak hedef hücre olarak parlak ve pürüzsüz bir zara sahip üç boyutlu bir şekil ile karakterize edilen sağlıklı bir nöron seçin ve video monitör ekranının merkezine ayarlayın.

Bir mikropipeti uygun hacimde potasyum iyon bazlı veya sezyum iyonu bazlı hücre içi çözelti ile doldurun. Ardından, mikropipeti elektrot tutucusuna yerleştirin ve hücre içi solüsyonun tutucunun içindeki gümüş tele temas ettiğinden emin olun. Mikropipeti odak noktasına getirin ve ACSF'ye daldırmak için mikromanipülatörü kullanın. Kir ve kalıntıları uzaklaştırmak için hafif bir pozitif basınç uygulayın.

Mikropipeti yavaş yavaş hedeflenen nörona doğru hareket ettirin. Pipet nörona yaklaştığında ve nöronal zar üzerinde çok küçük bir çukur oluştuğunda, bir gigaseal oluşturmak için pozitif basıncı serbest bırakın. Tutma potansiyelini, bir hücrenin fizyolojik dinlenme zarı potansiyeline yakın olan eksi 70 milivolta değiştirin.

Ardından, zarı yırtmak ve iyi bir tam hücre konfigürasyonu oluşturmak için mikropipete geçici ve yumuşak bir emme uygulayın. Dinlenme membran potansiyelinde 25 pikoamperlik artışlarla 25 ila 150 pikoamperlik bir dizi bir saniyelik depolarize edici akım darbeleri ile akım kelepçesindeki her bir nöronun ateşleme modelini test ederek ateşleme özelliklerini kaydedin.