Fare Retina Dilimlerinin Nöronlarında Işık Uyarılmış Postsinaptik Yanıtlar

Karanlık bir odadaki kayıt odasının içinde karanlığa uyarlanmış bir fare retinal dilimi alın. Retina, bir kapak kaymasının üzerine yerleştirilmiş destekleyici bir yapay taban üzerine oturur. Dilimi aCSF ile perfüze edin.

Retinal sinir ağı, ganglion hücreleri ile sinaps yapan bipolar hücrelere sinaptik olarak bağlı fotoreseptörleri içerir.

Retinanın yakınına bir kayıt pipeti yerleştirin.

Mikroskop altında, bir hedef ganglion hücresine yaklaşırken pozitif basınç uygulayın.

Bir zar yamasını çekmek için negatif basınca geçin, ardından sitoplazma ile süreklilik sağlamak için yırtın.

Karanlıkta, fotoreseptör zarı depolarize kalır ve nörotransmitter salınımına yol açar.

Bipolar hücre reseptörlerine bağlanan nörotransmiterler, sinyal iletimini inhibe ederek katyon kanalının kapanmasını tetikler.

Fotoreseptörleri hiperpolarize etmek için bir ışık darbesi uygulayın. Azalan nörotransmitter salınımı, bipolar hücrelerde katyon kanalı açılmasını tetikler.

Katyon akışı, ganglion hücre reseptörlerine bağlanan nörotransmitter salınımını indükler ve pipet tarafından kaydedilen uyarıcı bir sinaptik sonrası potansiyel oluşturur.

Yama kelepçeli kayıtlar için, perfüzyon tüplerini Ames besiyeri ile doldurun ve tüm kabarcıkların tüpten geçmesine izin verin. Cam çektirme ile pipetleri kaydettikten sonra, ucu pipet solüsyonu ile doldurun. Ardından, pipetin yaklaşık üçte birini doldurmak için bir mikropipet dolgusu kullanın. Doldurulduktan sonra, her pipeti nemli bir pipet kutusunda saklayın.

Ardından, bilgisayar, amplifikatör, CCD kamera ve mikroskop dahil olmak üzere yama kelepçesi kayıtları için ekipmanı açın. Karanlık koşullarda çalışırken, kızılötesi bir görüntüleyici yardımıyla mikroskop sahnesine bir retina dilimi preparatı yerleştirin. İmmobilize olduktan sonra sürekli perfüzyona başlayın.

Perfüzyon sıcaklığını 33 ila 37 santigrat dereceye ayarlayın. Dilim yüzeyini bir CCD kamera ile görüntüleyin. Hedef hücre tiplerinin bulunduğu hedef konuma odaklanın. Yama kelepçesi kaydı için sağlıklı görünen bir hücre seçin. Sağlıklı bir hücre tanımlandıktan sonra, bir pipet tutucusuna bir kayıt pipeti yerleştirin ve pipeti dilim hazırlığına ilerletin.

Dilim hazırlığına yakın olduğunda, mikroskop ile pipetin ucunu bulun. Pipet ucu mikroskop altında göründüğünde, ucu hedef hücreye doğru aşağı doğru hareket ettirin. Ardından, amplifikatörü ayarlayın ve pipeti nanoamper başına picoamp 5 voltta ayarlayın. Yaklaşık 5 milivolt ve yaklaşık 10 hertz'lik iki sürekli elektrik darbesi başlatın ve pipet direncini kontrol edin.

Çoğu retinal nöron için ideal bir direnç 5 ila 12 megaohm arasındadır. Hazır olduğunda, pipetin ucu hedef hücrenin yüzeyine gelene kadar iç çözeltiyi üflemek için bir ağızlık veya şırınga kullanın. Pozitif basınç hücre yüzeyinde küçük bir çukur oluşturduğunda, ucu hafifçe ilerletin ve üflemeyi durdurun.

Pipet direnci sürekli artıyorsa, bırakın ve direnci 1 gigaohm'dan daha büyük olana kadar izleyin. Direnç kendiliğinden artmazsa, gigaseal hale gelene kadar hafifçe negatif basınç uygulayın. Gigaseal elde edildikten sonra, tutma potansiyelini negatif 70 milivolt olarak değiştirin.

Ardından, pipet ucunun içindeki zarı yırtmak için aralıklı olarak negatif basınç uygulayın. Tüm hücre konfigürasyonu yapıldığında, pipet direnci 500 megaohm ile bir gigaohm arasında olabilir ve kapasitif akım gözlemlenebilir. I-V ilişkisini negatif 80 ila 40 milivolt arasında kaydedin. Hücre tipine bağlı olarak farklı voltaj kapılı kanal türleri etkinleştirilecektir. Son olarak, ışıkla uyarılmış sinaptik akımları veya voltajları kaydedin.