JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 3:11 dk • July 8th, 2025
Açıkta kalan kasları ve sinir dalları ile disseke edilmiş bir Drosophila larvası içeren bir Petri kabını mikroskop aşamasına yerleştirin.
Petri kabı içindeki bir banyo solüsyonuna bir referans elektrodu yerleştirin.
Bir kayıt elektrodunu izotonik bir çözelti ile doldurun.
Bir mikromanipülatör kullanarak, bu elektrodu motor nöronlar tarafından innerve edilen bir karın kasının üzerine yerleştirin.
Elektrot ucunu, akson ucunda nörotransmiterler içeren bir yapı olan sinaptik bir bouton üzerine yerleştirin.
Spontan nörotransmitter salınımına yanıtlar olan minyatür uyarıcı bağlantı akımlarını veya mEJC'leri sürekli olarak kaydedin.
Doğru mEJC genlik aralığı, doğru elektrot konumlandırmasını doğrular.
Ardından, hedeflenen kası innerve eden aksonun yanına bir stimülasyon elektrodu yerleştirin.
Aksonu elektrotun içine çekmek için negatif basınç uygulayın.
Bir aksiyon potansiyelini indüklemek için stimülasyon akımını kademeli olarak artırın.
Bu, aksonu, sinaptik akımlar olarak kaydedilen nöromüsküler kavşakta nörotransmiterleri serbest bırakması için tetikler.
Preparatla birlikte petri kabını mikroskop tablasına yerleştirin. Referans elektrodunu banyoya yerleştirin. Kayıt elektrodunu HL3 solüsyonu ile doldurun. 10x objektifin altında, elektrodu banyoya daldırın ve mikro manipülatörü kullanarak karın segmenti 2, 3 veya 4'ün altı ve yedi kaslarının üzerine yerleştirin.
Ardından, hedefi 60X'e getirin ve epi-floresan veya DIC optiklerini kullanarak ilgilenilen alana odaklanın. Elektrotun ucunu sinaptik butonların üzerine yerleştirin, ardından elektrodu kasın üzerine çok nazikçe bastırın, çünkü aşırı basınç NMJ'ye zarar verebilir veya spontan sinaptik aktivitede bir artışa neden olabilir.
Ardından, amplifikatörü, AD kartını ve bilgisayarı açın. Ardından, amplifikatör üzerinde voltaj kelepçesi modunu seçin. Alım yazılımını başlatın ve Boşluksuz modu seçin ve bilgisayar ekranında mEJC'lerin görünümünü gözlemleyin. mEJC'lerin genliğinin 0,2 ila 0,7 nanoamper aralığında olduğundan emin olun.
Görsel kontrol altında bir mikro manipülatör kullanarak, stimülasyon elektrodunu akson innerve edici abdominal segmentler 2 ila 4'ün yakınına yerleştirin. Elektrot tutucusuna bağlı şırınganın pistonunu çekerek negatif basınç uygulayın, böylece akson elektrotun içine çekilir.
Ardından, stimülatörü açın. Sıfır akımı ayarlamak için izolasyon ünitesindeki düğmeyi çevirin ve ardından EJC'ler görünene veya eşiğe ulaşılana kadar yavaşça artırın. Stimülasyonu, EJC'lerin gözlemlenmesi için eşik eşiğine kıyasla yaklaşık iki kat arttırılmış stimülasyon akımı ile eşik üstü bir rejimde gerçekleştirin.