Name: Subkutan Muskarinik Antagonistleri Yönetim ve Farelerde levator Auris longusun Triple-immün (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Öğrenin, farelerde levator auris longus kasına subkutan muskarinik antagonistler uygulayarak nöromusküler bağlantı morfolojisindeki değişiklikleri incelemeyi. Üçlü immün boyama ve konfokal mikroskopi ile sinir-kas sinyalizasyonunu araştırın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Müsküler Distrofi Derneği, NIH (NS062320) tarafından desteklenmiştir.

1. Muskarinik asetilkolin reseptör (mAChR) antagonistleri subkutan uygulanması <ol><li> 1.5mL reaksiyon tüp içinde steril serum fizyolojik uyuşturucu eriterek mAChR antagonisti aseptik koşullarda, uygun doz, (bkz. Tablo) altında hazırlayın. Aşağıdaki antagonistleri kullanıldı: atropin, Methoctramine, 4-DAMP AFDX-116, AFDX-384, MT 7. </li><li> A1cc insülin enjektörü çözüm 50μl çizin ve her bir fare için ayrı bir şırınga kullanın. Ayrıca, sadece kontrol grubunda her fare için serum fizyolojik içeren şırınga hazırlar. Enjekte etmek için hazır olana kadar buz üzerinde şırınga tutun. </li><li> Uygun anestezi derinliği tutam ayak yanıt eksikliği gözlemleyerek, ketamin ksilizin kokteyl (120 mg / kg ketamin, 8 mg / kg xylazine) fareler anestezi. </li><li> Uygun sedasyon sonra, boyun kaudal bölge başkanı rostral bölgeyi kapsayan saç tıraş,% 70 etanol ile uzak kalan saç silin. </li><li> Place stereomicroscope altında fare ve şırınga, iğne (Şekil 1A, B) hafifçe yukarı çekerken LAL kas iğne paralel eklemek. Bu bağ dokusu üzerinde iğne sokulur ve LAL kas kendisi doğrudan zarar vermez sağlar. Iğne ucu LAL kas kaudal yönünü kapsayacak şekilde yerleştirin. </li><li> Çok yavaş şırınga geri çekilirken doğru LAL kas üzerinde çözüm enjekte etmeye başlar; toplam enjeksiyon süresi yaklaşık 1 dakika olmalıdır. Düzgün bir şekilde enjekte edilirse, çözüm örten deride en az bir saat kalacak, yaklaşık 1 cm çapında bir "dome" oluşturmalıdır. Düzgün enjekte çözüm sağ LAL kas tüm rostral ve kaudal bölgeleri kapsayacaktır. </li><li> 1 ila 7 gün boyunca her 12 saatte bir aynı işlemi tekrarlayın. Diğer studies1 için, büyüme faktörleri, her 12 saatte bir 21 gün kadar enjekte etmek için aynı protokol kullanılır. 21 güne kadar, anestezi 2x bir gün ile uygulanan farelerde anormal tepkiler gözlendi. </li></ol> 2. LAL kaslarının diseksiyonu <ol><li> Pentobarbital sodyum aşırı dozda (390 mg / kg) ile fareler Euthanize. Ölüm torakotomi sonra kalp atışı eksikliği değerlendirerek güvence altına alınmıştır. </li><li> 1 pin ve burundan 1 pin her pençe, bir diseksiyon çanak dorsal tarafına fareyi yukarı aşağı pin. </li><li> Sol, sol kürek kemiği çevresinde bölgeye kulak sadece proksimal bölgeden LAL birlikte kesmek için küçük yaylı makas kullanılarak, sadece deri yoluyla ilk kesi olun. </li><li> Bu bölgede cilt dikkatlice çıkarın, ama bu doğru LAL kas ek puan olarak sağ kulak çok yakın kesme önlemek. </li><li> Başın yüzeysel yüzeyinde orta hat boyunca sağ ve sol LAL kasları karşılayan lipid merkezi bir konuma sahip yağ dokusu şeridi, bulun. Küçük yaylı makas kullanılarak, omuz (Şekil 1C) ulaşana kadar sağ sol LAL kas proksimal kenarından yağ dokusu (sol kulak doğru) 1cm kesti. </li><li> Bir kez kesi, geriye doğru LAL kas kas ventral tarafında ortaya çıkarmak için küçük forseps ile soyma yapılır. Forseps (Şekil 1C) ile sağ LAL kas dikkatle yukarı çekerken, bağ dokusu ve fasya kesin. </li><li> Kulağının dibinde kaudal sonuna doğru LAL etrafında kesin. , Kesim, sağ kulak rostral sonuna doğru hareket, sağ LAL (Şekil 1C) devredildi tutarak devam edin . LAL kendisi zarar riski daha bu aşamada daha fazla doku dahil etmek daha iyidir. Kas, pipet 1X PBS kas üzerinde kurumaya başlar. </li><li> Place 1X PBS, dorsal tarafına içeren 30mm kültür Sylgard çanak LAL disseke. Küçük böcek iğneli kas dört köşe aşağı pin. </li><li> Sağ LAL kas dorsal ve ventral yüzeyleri küçük forseps ve yaylı makas, temiz, bağ dokusu kullanma. Ventral yüzeyi temizlemek için kas ters çevirin ve yeniden-pin. 2-3 kaslar aynı 30mm çanak yerleştirilmiş olabilir. </li></ol> 3. LAL NMJs Triple immün: 1. Gün <ol><li> Başında immün önce, gerekli tüm reaktifler hazırlamak. 1X PBS,% 2 sığır serum albumin BSA) / PBS,% 2 0.1M Glycine BSA / PBS,% 2 BSA / PBS, ve% 4 1X PBS paraformaldehid (PFA)% 0.2 Triton X100 ihtiyaç duyulacaktır. -20 ° C derin dondurucuda Pre-soğuk metanol. </li><li> Bu işlem sırasında çanak dorsal tarafına tutturulmuş LAL kasları bırakın. 1X PBS çözümü atın ve kas karşılamak için yeterli% 4 (PFA) ekleyebilirsiniz. Çalkalayıcı yerleştirin çanak 20 dakika boyunca 2 veya 3 hız ayarlayın. Aksi belirtilmedikçe, aşağıdaki adımları çanak çalkalayıcı üzerinde yer olmalıdır. </li><li> % 4 PFA atın kas ve 1X PBS 3 kez, 10 ', her ile yıkayın. </li><li> Son 1X PBS 2% 30 'BSA / PBS çözüm 0.1M Glycine yıkayın ve eklemek atın. </li><li> 0.1M Glycine çözümü bir atınd eklemek 1X PBS 1:200 15 'lik bir konsantrasyon rodamin konjuge α-bungarotoxin içeren. </li><li> Α-bungarotoxin çözüm atın ve 1X PBS, 3 kez 10 'her kas yıkayın. </li><li> Ön soğutmalı metanol ekleyerek doku Permeabilize ve tam 5 dakika boyunca -20 ° C derin dondurucuda çanak, hiçbir ihtiyaç sallayarak. </li><li> Metanol çıkarın ve 3 kez 10 'her 1X PBS ile yıkayın. Ile son yıkama ve blok doku atın% 0.2 triton X-100,% 2 BSA / PBS 1 saat. Yıkama ve engelleme adımları oda sıcaklığında yapılır. </li><li> 4, titreme, gecede kasları inkübe ° C primer antikorları bloke çözüm (bkz. Tablo) seyreltilmiş bir kokteyl. </li></ol> 4. LAL NMJs Triple immün: 2. Gün <ol><li> 1X PBS 3 kez, 10 'oda sıcaklığında her kasları yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat (bkz. Tablo) çözümü engelleme ikincil antikor kokteyli ekleyin. Foto-Alexa-Fluor 647 floresan beyazlatma önlemek için kasların bu adımı itibaren ışıktan korunmalıdır. </li><li> 1X PBS 3 kez, 10 ', her kasları yıkayın. </li><li> 1X PBS içinde kalan bağ dokusu Temiz, LAL kasların lateral sınırları kesilmiş ve slaytlar dorsal tarafına monte cam kapak fişleri ve montaj medya kullanarak. Yerinde kapak kayma güvenliğini sağlamak için açık bir oje kullanın. </li><li> Analiz için hazır olana kadar -20 ° C'de ışık ve mağaza slaytlar koruyun. </li></ol> 5. LAL NMJs Konfokal görüntüleme <ol><li> Yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüler, Leica TCS 4D konfokal mikroskop Leica Planı Apo 63X yağ objektif (1.4NA) ile elde edilir. </li><li> Floresein ve Alexa 647 sinyalleri aynı anda sırasıyla, lazer çizgileri 488 nm (Argon, 488 nm, 20 mW) ve 633 nm (HeNe, 633 nm, 10 mW) ile tarandı. Sırayla, rodamin sinyal sonra lazer hattı ile 561 nm (DPSS, 561, 20 mW) taranır. Optik bölümleri 0.3 mikron aralıklarla toplanan ve z-düzleminde görüntü sayısı 60-80 arasında değişiyordu. Iğne deliği Airy 1 (107,97 um) göre ayarlanır. Görüntü formatı 1024 x 1024 (X, Y), az 1 234,32 mm x 234,32 mm ve 229,05 nm x 229,05 nm piksel boyutunda bir görüntü boyutu 400Hz hızlı bir zoom faktörü. </li><li> Leica TCS-NT kazanım yazılım sonra maksimum yoğunluğu projeksiyonları z serisi görüntüleri yeniden oluşturmak için kullanılır. </li><li> Multipanel görüntüleri Adobe Photoshop kullanarak, parlaklık ve kontrast ayarlanır. </li><li> Tipik bir LAL kas için, biri yaklaşık 75-100 tr yüz NMJs analiz etmek gerekir. Synaptic istikrar gibi pre-, peri-ve postsinaptik unsurların mekansal uyumu (yani sinir, Schwann hücreleri ve kas) gibi özellikleri ve sinaptik alan ölçümleri (yani sinaps boyutu) tarafından belirlenir. </li></ol> Temsilcisi sonuçları: Nikotinik AChRs postsinaptik kümeleri (Kırmızı Şekil 2) tam apposed tek bir kas lifi, yetişkin bir memeli NMJ, tek bir motor akson son derece sinir terminal farklılaşmış milleri (Yeşil Şekil 2) formunu ince dalları ayrıntılarına . Perisynaptically, terminal Schwann hücreleri sıkı presinaptik sinir terminalleri (Blue Şekil 2) tüm dallarını kapsamaktadır. Bu üçlü organizasyonun yapısal ve işlevsel bütünlüğü ciddi alt tipi özel mAChR inhibitörleri günlük uygulama tarafından rahatsız. Burada sunulan örnek (Şekil 3), 4-DAMP, M1, M3, M4 ve M5 mAChR alt tipleri için yüksek afinite ile mAChR antagonisti (Şekil 3B, kas yüzeyi boyunca sayısız NMJs sinir terminallerine seçici eleme çağrıştırıyor C). Buna ek olarak, terminal Schwann hücrelerinin süreç uzantısı olmadan parlak S100 etiketleme (Şekil 3B, 3C) ile kanıtlanan 8 anormal suskun. Postsynaptically, kas lifleri normal ve nAChRs, hiçbir kayıp vardır (Şekil 3B, 3C). <img src="/files/ftp_upload/3124/3124fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 LAL kas Anatomik yeri ve organizasyonu. Rostral (rLAL), kaudal (cLAL) ve LAL sinir (LALn) ve buna karşılık gelen uç plakası bantları yeri (A, içerlek) gösterilmiştir. LAL kas göre iğne konumu ve enjeksiyon işlemi (B) gösterilmiştir. Kesi noktaları diseksiyon prosedürü (C) gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/3124/3124fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 NMJ Üçlü organizasyonu. Yüksek büyütmeli bir fare NMJ konfokal kez. Tek bir akson terminal Schwann hücresi ve süreçler (terminali Schwann hücre gövdeleri A ', yıldızlarla noktası) tarafından sıkıca kapalı ince terminal dalların (A), ayrıntılarına. Postsynaptically bir kas lifi, nikotinik AChRs bir küme hassas sinir terminaline dalları apposed.yalleri ve terminal Schwann hücresi. <img src="/files/ftp_upload/3124/3124fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 LAL kasları 4-DAMP, mAChR antagonisti ile tedavi. LAL kasların Düşük ve yüksek büyütmeli konfokal kez araç ya da 4-DAMP ile tedavi edildi. Araç ile tedavi edilen kas (4 DAMP tedavi kas eksikliği sinir terminalleri (A-A'''), sayısız NMJs aksine B-B ', C-C'''). Şekil 2B kutulu alan Şekil 2C yakınlaştırılmış.

<ol><li>Wright, M. C., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+neurotrophic+factor+is+not+required+for+terminal+sprouting+and+compensatory+reinnervation+of+neuromuscular+synapses%3A+re-evaluation+of+CNTF+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice.</a> Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).</li>
<li>Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+motor+neuron+sprouting+in+vivo+by+ciliary+neurotrophic+factor+and+basic+fibroblast+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Induction of motor neuron sprouting in vivo by ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor.</a> J Neurosci. 12, 3241-3247 (1992).</li>
<li>Caroni, P., Aigner, L., Schneider, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+neuronal+determinants+locally+regulate+extrasynaptic+and+synaptic+growth+at+the+adult+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 136, 679-692 (1997).</li>
<li>Witzemann, V., Brenner, H. R., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+factors+regulate+AChR+subunit+mRNAs+at+rat+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural factors regulate AChR subunit mRNAs at rat neuromuscular synapses.</a> J Cell Biol. 114, 125-141 (1991).</li>
<li>Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+levator+auris+longus+muscle+of+the+mouse%3A+a+convenient+preparation+for+studies+of+short-+and+long-term+presynaptic+effects+of+drugs+or+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins.</a> Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).</li>
<li>Lanuza, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-+and+postsynaptic+maturation+of+the+neuromuscular+junction+during+neonatal+synapse+elimination+depends+on+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22C.+J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Pre- and postsynaptic maturation of the neuromuscular junction during neonatal synapse elimination depends on protein kinase.</a> C. J Neurosci Res. 67, 607-617 (2002).</li>
<li>Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+effects+of+beta-amyloid25-35+peptide+aggregates+on+transmitter+release+in+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).</li>
<li>Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+patterns+of+motor+nerve+terminal+sprouting+induced+by+ciliary+neurotrophic+factor+vs.+botulinum+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin.</a> J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).</li>
<li>Wright, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+muscarinic+acetylcholine+receptor+subtypes+contribute+to+stability+and+growth%2C+but+not+compensatory+plasticity%2C+of+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses.</a> J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).</li>
<li>Voss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+ATP+inhibits+chloride+channels+in+mature+mammalian+skeletal+muscle+by+activating+P2Y1+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y1 receptors.</a> J Physiol. 587, 5739-5752 (2009).</li>
<li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).</li>
<li>Dorje, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonist+binding+profiles+of+five+cloned+human+muscarinic+receptor+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes.</a> J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).</li>
<li>Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+Union+of+Pharmacology.+XVII.+Classification+of+muscarinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors.</a> Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan yöntem memeli NMJs istikrar ve bakım sinyalizasyon alt tipi özel mAChR önceden tanınmayan rolleri soruşturma izin verir. Bu yöntem ayrıca nörotrofik faktörler ve farmakolojik ajanların etkilerini test etmek için faydalı olacaktır. Örneğin, laboratuar Silier Nörotrofik Faktör (CNTF) yetişkin farelerde neredeyse tüm LAL sinir terminallerinden çimlenme yol açtığını <a>1</a> . Bu sonuç ca az çimlenme orta bildirdi CNTF ile tedavi edilen arka bacak kasları, önceki çalışmalarla tezat. Gluteus ve yanal gastrokne...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> ketamin </td><td> Hospira </td><td> NDC0409-2051-05 </td><td> Doz: 120mg/kg </td></tr><tr><td> ksilizin </td><td> Lloyd Laboratuvarları </td><td> LA33806 </td><td> Doz: 8mg/kg </td></tr><tr><td> atropin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0132 </td><td> (&gt;% 98 saflıkta); Doz: 0.2mg/kg - 20mg/kg </td></tr><tr><td> atropin </td><td> Voigt Global Dağıtım </td><td> AT105 </td><td> İlaç grade </td></tr><tr><td> Methoctramine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M105 </td><td> Doz: 100 - 400M </td></tr><tr><td> 4-DAMP </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D142 </td><td> Doz: 2.5mg/kg </td></tr><tr><td> AFDX-116 </td><td> Bioscience Tocris </td><td> 1105 </td><td> 250M </td></tr><tr><td> AFDX-384 </td><td> Bioscience Tocris </td><td> 1345 </td><td> 50M - 500M </td></tr><tr><td> MT 7 </td><td> Peptitler Uluslararası </td><td> PMT-4340-s </td><td> 0.1M - 1M </td></tr><tr><td> 1X Fosfat Tuzlu, pH 7.4 Tamponlu </td><td> Invitrogen </td><td> 10010049 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehit </td><td> Balıkçı </td><td> T353-500 </td><td> 10g/100mL deiyonize distile su eriterek ilk% 10&#39;luk olun; 1X PBS ile% 4, pH 7.4 &#39;e ayarlamak </td></tr><tr><td> Pentobarbitol Sodyum </td><td> Virbac Hayvan Sağlık </td><td> NDC-051.311-050-01 </td><td> Doz: 390mg/kg </td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Dow Corning </td><td> Bölüm # 184 </td><td> Ihtiyaçlarına bağlı olarak birden fazla ölçekli kültür çanak kullanabilirsiniz (30mm, 60mm, 100mm), kit ile birlikte gelen yönergeleri izleyin </td></tr><tr><td> 0.1M Glycine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-7126 </td><td> % 2 BSA / PBS 0.185g için 25ml </td></tr><tr><td> % 2 Sığır serum albumin (% 2 BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3059-100g </td><td> 1X PBS 100 ml içine 2g BSA çözülür </td></tr><tr><td> % 2% 0.2 Triton X 100 BSA / PBS (Engelleme Tampon) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9284-100 ml </td><td> 0.2ml/100mL% 2 BSA / PBS çözülür </td></tr><tr><td> α-bungarotoxin </td><td> Invitrogen </td><td> T1175 </td><td> 1:200, konsantrasyon kullanın </td></tr><tr><td> SMI-312 </td><td> Sternberger Monoclonals </td><td> SMI312 </td><td> 1:1000 konsantrasyon kullanın </td></tr><tr><td> SV2 </td><td> Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası </td><td> SV2-Süzüntü </td><td> 1:10 konsantrasyonda kullanın </td></tr><tr><td> S100 </td><td> Dako </td><td> Z0311 </td><td> 1:400, konsantrasyon kullanın </td></tr><tr><td> FITC-keçi anti-fare IgG1 </td><td> Roche </td><td> 03117731001 </td><td> Konsantrasyonu 1:200 kullanın, ama arka planda yüksek ise, 1:400 deneyin </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 konjuge keçi anti-tavşan </td><td> Invitrogen </td><td> A21244 </td><td> 1:200, konsantrasyon kullanın </td></tr><tr><td> Vectashield floresan montaj medya </td><td> Vektör laboratuvarlar </td><td> H-1000 </td><td> Bu sert ayarlanmış bir medya değil, açık bir oje ile kapak kayma güvenliğini sağlamak için gerekecektir. </td></tr><tr><td> Küçük Bahar Makas </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 15002-08 </td><td></td></tr><tr><td> Diseksiyon forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr></tbody></table>

subkutan muskarinik antagonistleri yönetim ve farelerde levator auris longus&#39;un triple-immün

Subcutaneous Administration of Muscarinic Antagonists and Triple-Immunostaining of the Levator Auris Longus Muscle in Mice

Gastroknemius ve tibialis anterior gibi kemirgenler, Hind bacak kasları memeli NMJs oluşumu ve korunması için gerekli sinyalleri in vivo farmakolojik çalışmalarda sık sık kullanılır . Ancak, subkutan veya intramusküler uygulamadan sonra bu kasların içine ilaç penetrasyonu genellikle eksik ya da düzensiz ve birçok NMJs etkilenmez. Mini pompaları gibi cihazlar ile sistemik yönetim Spatiotemporal etkilerini artırabilir olsa da, bu yaklaşımın invaziv doğası karıştırıcı inflamatuvar yanıtları ve / veya doğrudan kas hasarına neden olabilir. Ayrıca, zaman alıcı bir seri kesit ve kapsamlı immün gerektirdiğinden bir arka bacak kas NMJs tam analizi zordur. Fare LAL boyun dorsum yüzeysel olarak bulunan ince bir kas, düz levha. Bu, hızlı kasılan kas fonksiyonları kulak kepçesi taşımak için. Kafatası orta hat kaynaklanan ve her kepçesi kıkırdak kısmının yanal uzatmak rostral ve kaudal kısımları içerir. Kas çıkar Stylomastoid foramen olarak kaudal projeler yüz sinirinin bir şube tarafından verilir. Biz ve diğerleri, hem de kısa ve uzun vadeli NMJs ve kasları ilaçların in vivo etkilerinin araştırılması için avantaj sunan uygun bir hazırlık olması amacıyla LAL bulduk . İlk olarak, yüzeysel bir konumda, hafif anestezi altında ilaçlar birden fazla yerel uygulamaları kolaylaştırır. İkincisi, inceliği (2-3 kat kas liflerinin), kas içinde hemen hemen tüm NMJs görselleştirme ve analiz izin verir. Üçüncü olarak, onun innervasyon deseni ile birlikte sinir bozulmadan diseksiyon kolaylığı, ek elektrofizyolojik analizi, in vitro 9,5 izin verir. Belki de son ve en önemlisi, uygulanan küçük bir hacim (~ 50μl) kolayca tüm kas yüzeyi kapsayan tüm NMJs ilaç düzgün ve uzun süreli maruz kalma sağlar ve sistemik bir yaklaşım 1,8 ihtiyacını ortadan kaldırır .

Levator auris longus (LAL) genç erişkin farelerin kas muskarinik sinyalizasyon inhibitörleri tekrarlanan yönetim ve wholemounts nöromüsküler kavşak sonraki immün (NMJs) için prosedürleri açıklar. LAL kas ifşa ettiği için benzersiz avantajları vardır.<em&gt; In vivo</em&gt; NMJs farmakolojik etkileri.

Subkutan Muskarinik Antagonistleri Yönetim ve Farelerde levator Auris longus&#39;un Triple-immün

Gastrocnemius ve tibialis anterior gibi kemirgenlerin arka ekstremite kasları, sinyallerin in vivo farmakolojik çalışmaları için sıklıkla kullanılmaktadır...

Bu prosedürün genel amacı, yetişkin farelerin LAL kaslarına muskarinik antagonistler uygulamak ve muskarinik asetilkolin reseptörlerinin inhibisyonuna yanıt olarak njs'lerdeki morfolojik değişiklikleri incelemektir. İlk olarak, muskarinik antagonistler istenen sıklık ve sürede deri altına uygulanır. Ötanazi sonrası, işlem görmüş LAL kasları dikkatlice diseke edilir ve tüm bağ dokusu temizlenir.Ardından, standart immünohistokimyasal yöntemler kullanılarak motor sinir Schwann hücrelerini ve nikotinik asetilkolin reseptörlerini görselleştirmek için kas dokusu üçlü immüno-etiketlenir. Son olarak, muskarinik antagonistlerlele işlem görmüş kaslardaki NMJ'lerin morfolojik değişikliklerini incelemek için konfokal mikroskopi kullanılır. Nihayetinde, muskarinik asetilkolin reseptörlerinin inhibisyonu aracılığıyla tripartite NMJ'nin morfolojik organizasyonunun ciddi şekilde bozulduğunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu tekniğin, rodent arka bacağının gastroknemius ve tibialis anterior gibi iskelet kaslarına farmasötik bileşiklerin uygulanması gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, LAL kasının daha erişilebilir ve nispeten ince olmasıdır. Bu durum, ilaçların tekrarlayan lokal uygulamasını ve kas içindeki neredeyse tüm njs'lerin laboratuvar tezgahı üzerinde görselleştirilmesini sağlar. Etanol ile temizlenmiş bir laboratuvar tezgahı üzerinde, uygun doz muskarinik asetilkolin reseptör antagonistini, 1,5 ml'lik bir reaksiyon tüpünde steril fizyolojik salin içerisinde çözün. Her fare için ayrı bir şırınga kullanarak, 1 cc'lik bir insülin şırıngasıyla 50 µL çözelti çekin.Ayrıca kontrol grubundaki her bir fare için sadece fizyolojik serum içeren şırıngalar hazırlayın ve tüm şırıngaları enjekte edilene kadar buz üzerinde tutun. Ardından fareleri ketamin xylazin kokteyli ile anesteziye alın. Uygun sedasyon sonrası pençe sıkıştırma tekniğini kullanarak anestezinin gerçekleştiğini doğrulayın, başın rostral bölgesinden boynun koddal bölgesine kadar olan tüyleri tıraş edin ve kalan tüyleri %70 etanol ile temizleyin. Fareyi bir stereo mikroskop altına yerleştirin ve şırınga iğnesini, ucu koddal yönü kapsayacak şekilde LAL kasına paralel olarak yerleştirin.İğnenin üstteki bağ dokusuna yerleştirildiğinden ve LAL kasına doğrudan zarar vermediğinden emin olmak için şırınga iğnesini hafifçe yukarı çekin. Şırıngayı yaklaşık bir dakika boyunca geri çekerken, çözeltiyi sağ LAL kasının üzerine çok yavaş bir şekilde enjekte etmeye başlayın. Doğru şekilde enjekte edildiğinde, çözelti üstteki ciltte en az bir saat boyunca kalacak bir kubbe oluşturmalıdır.Kas diseksiyonundan önce, bir ila yedi gün boyunca her 12 saatte bir prosedürü tekrarlayın, fareyi ötanize edin ve ardından bir diseksiyon kabına sırtı yukarı gelecek şekilde sabitleyin. Kulakça proksimal bölgeden sol kürek kemiği çevresindeki bölgeye kadar sol LAL boyunca kesmek için küçük yaylı makas kullanarak sadece cilt üzerinden ilk insizyonu yapın. Bu bölgedeki cildi dikkatlice kaldırın, ancak sağ LAL kasının tutunma noktalarından biri olduğu için sağ kulağa çok yakın kesmekten kaçının.Küçük yaylı makas kullanarak, sağ ve sol LAL kaslarının birleştiği başın yüzeyel kısmındaki merkezi konumlu adipöz doku şeridini bulun. Yağ dokusunun bir santimetre sağına ve sol LAL kasının proksimal kenarından sol kulağa doğru, omuza ulaşana kadar kesi yapın. Kesi yapıldıktan sonra, kasın ventral tarafını açığa çıkarmak için sağ LAL kasını küçük bir pensle geriye doğru sıyırın.Pensle sağ LAL kasını dikkatlice yukarı çekerken bağ dokusunu ve fasyayı temizleyin. Kulağın tabanında, sağ LAL'nin kaudal ucunun etrafından kesin ve sağ kulağın rostral ucuna doğru ilerleyin. Sağ LAL'yi ters dönmüş halde tutun.Bu adımda, LAL'ye zarar verme riskini göze almaktansa daha fazla doku dahil etmek daha iyidir. Kas kurumaya başlarsa, kasın üzerine 1 XPBS pipetleyin.Diseke edilmiş sağ LAL'yi, içinde 1 XPBS bulunan 30 milimetrelik bir kültür sigara tabağına dorsal tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Kasın dört köşesini, küçük bir pens ve yaylı makas kullanarak küçük böcek iğneleriyle sabitleyin. Sağ LAL kasının dorsal yüzeyindeki bağ dokusunu temizleyin.Ventral yüzeyi temizlemek için kası ters çevirin ve yeniden iğneleyin. Bir gecelik primer antikor inkübasyonunun ardından, üçlü immün boyama için iki ila üç kas aynı 30 milimetrelik kaba yerleştirilebilir.Kasları bir kez XPB ile 3 defa 10 dakika boyunca yıkayın ve ardından bloklama çözeltisi içindeki sekonder antikor kokteylini ekleyip bir saat bekletin. Bir saatlik inkübasyondan sonra, fotobeyazlamayı önlemek için kasları oda sıcaklığında ışıdan koruyarak inkübe edin, ardından kasları bir kez XPB ile 3 defa 10 dakika boyunca yıkayın. Son yıkamadan sonra kasları stereo mikroskop altında taze bir XPBS içinde kapalı tutarak kalan tüm bağ dokularını temizleyin ve ardından LAL'nin lateral sınırlarını kesin.Kas dokusunu sırt kısmı yukarı bakacak şekilde lama monte edin. Ardından iki veya üç damla montaj medyumu ekleyin. Lamelleri yerleştirin ve bunları sabitlemek için şeffaf oje kullanın.Lamları ışıktan koruyun ve analiz aşamasına gelene kadar -20 °C'de saklayın. Üçlü immünboyama uygulanmış fare NMJ'nin yüksek büyütmeli konfokal görünümleri, tripartite organizasyonunu göstermektedir. NFS V two ile boyanmış tek bir aksondan çıkan ince terminal dallar, S 100 boyamasının ortaya koyduğu üzere, postsinaptik olarak terminal Schwann hücresi gövdeleri ve uzantıları tarafından sıkıca sarılmıştır.Bir kas lifinde, nikotinik asetilkolin reseptörlerinden oluşan bir küme, sinir uçlarının dalları ve terminal Schwann hücrelerinin tam karşısında yer alır. Araçla tedavi edilmiş bir farenin LAL kası, üçlü organizasyonu bozulmamış olan ve üçlü immün boyama ile gösterildiği üzere sinir ucunun tipik, yüksek derecede farklılaşmış dallarına sahip njs'leri sergiler. Buna karşılık, bu üçlü organizasyonun yapısal ve fonksiyonel bütünlüğü, dört damp'in günlük uygulamasıyla ciddi şekilde bozulmuştur.Alt tipe özgü bir muskarinik asetilkolin reseptör inhibitörü. Burada dörtlü damp, kas yüzeyi boyunca çok sayıda NJS'den sinir uçlarının seçici olarak ortadan kaldırılmasını tetikler. Ayrıca, işlem uzantısı olmaksızın parlak S 100 etiketlemesiyle kanıtlandığı üzere, terminal Schwann hücreleri anormal şekilde durgundur.Bu videoyu izledikten sonra, muskarinik antagonistlerin LAL kaslarına nasıl uygulanacağını ve bu reseptörlerin inhibisyonuna yanıt olarak nöromüsküler kavşaklardaki (nj) morfolojik değişiklikleri incelemek amacıyla kasların nasıl üçlü immünboyama ile boyanacağını iyi derecede kavramış olmalısınız.

subcutaneous-administration-muscarinic-antagonists-triple

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Kemirgen solunum fizyolojisi ve solunum yolu inflamatuar hücrelerin örnekleme tekrarlanan ölçümler arzu edilir, ancak genellikle mümkün değildir. Burada sözlü havayolu inflamatuar hücrelerin havayolu hiperreaktivite ve örnekleme tekrarlanan ölçümler izin verir fareler Entübasyon için tekrarlanabilir bir yöntem açıklanmaktadır.

Havayolu Direnci Ölçümleri ve Fare Bronkoalveolar Lavaj Sıvısı Örnekleme için, geri dönüşümlü, Non-invaziv Yöntemi

Biz 2.0 mm spekulum ile bir otoskop kullanarak direkt laringoskopi yoluyla farelerde entübasyon için, basit, güvenilir ve nispeten ucuz bir yöntem geliştirdik. Bu teknik, atravmatik ve kronik deneylerde tekrarlanan ölçümler için de kullanılabilir. Biz üstün trakeostomi veya daha önce cerrahi dışı teknikler bildirdi bulabilirsiniz.

Farelerde Endotrakeal Entübasyon<em&gt; Via</emBir Otoskop Kullanma&gt; Doğrudan Larengoskopi

Bu mevcut protokol, canlı hayvanlarda nötrofil hazırlamanın dinamik sürecinin izlenmesini sağlamak için floresan raportörler, in vivo etiketleme ve intravital görüntüleme teknikleri kullanır.

IL-1β Promoter odaklı DsRed Muhabir Fare kullanma Nötrofil Hazırlama intravital Görüntüleme

İç kulağa lokal ilaç verilmesi için iki mikrocerrahi yaklaşım burada tanımlanmış ve işitme parametreleri, koklear sitomimari ve inflamatuar belirteçlerin ekspresyonu üzerindeki etkisi açısından karşılaştırılmıştır.

Fare İç Kulak Hedefli İlaç Dağıtım Yöntemleri Karşılaştırmalı İncelemesi: Bullostomy Karşı Transtimpanik Enjeksiyon

Burada, felç ve opticospinal iltihap transfer aquaporin-4 (AQP4) tarafından ikna etmek için bir iletişim kuralı mevcut-WT fareler içine AQP4- / - fareler belirli T hücrelerden. Buna ek olarak, seri optik Koherens tomografi görsel sistem disfonksiyon izlemek için nasıl kullanılacağını göstermektedir.

Felç ve görsel sistem yaralanma tarafından Nöromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4 T hücreleri belirli farelerde indüksiyon

Bu raporda açıklanan protokol nöromüsküler kavşak spontan kaydetmek için fare levator auris longus (LAL) kas ve postsinaptik potansiyeller (akım tipi kelepçe) sinir uyarılmış ve akımlar (gerilim tipi kelepçe) kullanır. Bu tekniğin kullanımı hastalık ve normal koşullar altında sinaptik aktarım mekanizmaları içine anahtar anlayışlar verebilir.

Levator Auris Longus Gerilim kelepçe koşullar altında memeli nöromuskuler iletim Sınavı Hazırlık

Biz tükürük toplama, fare trakeostomi ve üç büyük tükürük bezleri yalıtımı da dahil olmak üzere performans detaylı bir yaklaşım sunuyoruz.

Fare tükürük işlevsel değerlendirme Pilokarpin stimülasyon aşağıdaki yolu ile radyasyon şeker

Burada, fare cremaster kasının post-kılcal venüzlerinde intravital mikroskopinin nasıl yapılacağını gösteriyoruz. Yaygın olarak farklı inflamasyon ve sepsis modellerine, özellikle kemokinler ve sitokinler tarafından indüklenenlere uygulanan, abartılı kas lökosit infiltrasyonu içeren muscolopatilerin çalışmasında önemini vurguluyoruz.

İntravital Mikroskopi Ile Değerlendirilen Farelerde Cremaster Kasın Lökosit İnfiltrasyonu

Oküler yüzey iltihabı oküler yüzey dokularına zarar verir ve gözün hayati fonksiyonlarını tehlikeye atar. Mevcut protokol, oküler inflamasyonu indüklemek ve Meibomian bezi disfonksiyonunun (MGD) bir fare modelinde tehlikeye atılmış dokuları toplamak için bir yöntemi açıklamaktadır.

Oküler Yüzey Enflamasyonunun İndüklenmesi ve Tutulan Dokuların Toplanması

Burada, kraniyal levator auris longus (LAL) kasının in vivo elektroporasyonu ve denervasyonunu birleştiren bir protokol sunuyoruz. Bu prosedür, kas kaynaklı proteinlerin nöromüsküler sinapsın rejenerasyonundaki potansiyel rolünün incelenmesini sağlar.

Kranial Levator Auris Longus İskelet Kasının Kombine İn Vivo Elektroporasyonu ve Kısa Süreli Reinnervasyonu

Öğrenin, farelerde levator auris longus kasına subkutan muskarinik antagonistler uygulayarak nöromusküler bağlantı morfolojisindeki değişiklikleri incelemeyi. Üçlü immün boyama ve konfokal mikroskopi ile sinir-kas sinyalizasyonunu araştırın.

Subkutan Muskarinik Antagonistleri Yönetim ve Farelerde levator Auris longus'un Triple-immün

Daha fazla video keşfet