Bir Nöron-Astrosit Ko-Kültüründe Nöronal Ağın Elektrofizyolojik Aktivitesinin Kaydedilmesi

Çok elektrotlu bir dizi veya MEA plakası ile başlayın. Her kuyucuk, merkezi olarak konumlandırılmış bir elektrot dizisi içerir.

Dizi, hücre yapışmasını kolaylaştırmak için bir kültür substratı ile kaplanmıştır.

Dizinin üzerine bir damlacık olarak motor nöronların ve astrositlerin bir süspansiyonunu ekleyin.

Hücre bağlanmasına izin vermek için inkübe edin, ardından hücre canlılığını koruyan küçük bir molekül ile desteklenmiş sıcak bir ko-kültür ortamı ekleyin.

Kuluçka sırasında astrositler, nöronal olgunlaşmayı ve sinaps oluşumunu destekleyen faktörler salgılar ve bu da bir nöronal ağ ile sonuçlanır.

Nöronal aktiviteyi izlemek için MEA'yı fizyolojik koşullar altında bir kayıt cihazına yerleştirin.

Nöronlar, aksonları boyunca hareket eden aksiyon potansiyelleri adı verilen elektrik sinyallerini iletir.

Sinapsa ulaştıktan sonra, sinyal nörotransmitter salınımını tetikler ve sinyali bir sonraki nörona yayar.

Her bir kuyucuğun içindeki elektrotlar, sinaptik olarak bağlı nöronlar tarafından üretilen sinyalleri hücre dışı olarak kaydeder.

Senkronize ritmik elektrik sinyallerinin tespiti, bir nöronal ağın kurulmasını doğrular.

Kaplama gününde veya öncesinde, önce PLO'yu su veya PBS ile seyrelterek 24 oyuklu MEA plakalarını kaplamaya başlayın. Daha sonra, her bir kuyucuğa 15 ila 20 mikrolitre PLO ekleyin, kuyunun ortasında bir damlacık oluşturun, elektrot alanını kaplayın, pipet ucuyla elektrotlara zarar vermemeye dikkat edin.

Bölmelerin çevresindeki kuyucuklara su ekleyin, yeterli nem sağlayın ve PLO'yu 37 santigrat derecede 1 ila 2 saat inkübe edin. Ardından, plastik bir mikropipet ucu kullanarak, elektrotlara dokunmadan mümkün olduğunca fazla PLO aspire edin. Daha sonra, kuyuyu üç kez 250 mikrolitre su ile yıkayın.

Bir pipet ucu kullanarak mümkün olduğunca fazla suyu alın ve kapağı çıkarılmış halde yüzeyin kurumasını bekleyin. Daha sonra, her bir elektrot dizisini kaplamak için 15 ila 20 mikrolitre seyreltilmiş laminin ekleyin. Nem bölmelerine su ekledikten ve kapağı değiştirdikten sonra, 37 santigrat derecede en az iki saat ila gece boyunca inkübe edin.

Kaplama gününde, motor nöronları ve astrosit kültürlerini PBS ile bir kez duruladıktan sonra,% 0.05 tripsin ekleyin ve hücreleri kaldırmak için yaklaşık 5 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri, tripsin inhibitörü içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe toplayın ve tüm hücrelerin toplandığından emin olmak için plakaları orta veya baz ile yıkayın.

Hücreleri santrifüjleme ile aşağı doğru peletleyin ve daha sonra 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, 1 mililitre tek hücreli süspansiyon oluşturmak için 20 mikromolar ROCK inhibitörü içeren bir ko-kültür ortamı ile motor nöronları ve astrositleri yeniden süspanse edin. Bir hemositometre kullanarak motor nöronları ve astrositleri sayın ve sayarken hücre süspansiyonlarını kapatın ve bunları 4 santigrat derecede bir strafor rafa yerleştirin.

Her iki hücre süspansiyonunun 1 mililitresini 300 kez g'de 5 dakika santrifüjleyin. İstenilen hacmi hesaplayın ve peletleri yeniden askıya alın. Gerekli hacimde nöron ve astrosit süspansiyonlarını eşit oranlarda birleştirin ve iyice birleştirmek için iki kez pipetleyerek hafifçe karıştırın.

Daha sonra, plakanın her bir oyuğundan laminini çıkarın ve son kombine hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini her bir oyuğa aktarın ve elektrot dizisini kaplayan küçük bir damlacık oluşturun. Plakalar üzerinde ilk ataşmanları oluşturmak için plakaları 37 santigrat derecede 20 ila 30 dakika boyunca bozulmamış bir hücre damlası ile inkübe edin.

Daha sonra, her bir oyuğun duvarına ROCK inhibitörü içeren 250 mikrolitre ılık ko-kültür ortamını pipetleyin ve aynı hacmi her bir oyuğun karşı duvarına pipetleyin ve plakayı 24 ila 36 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, plakaları kalıntı veya ölü hücreler açısından inceleyin ve gerekirse ortamı ROCK inhibitörü içeren yeni bir ko-kültür ortamı ile değiştirin.

Aksi takdirde, 2. gün ko-kültürden başlayarak, ROCK inhibitörü olmayan bir ko-kültür ortamı kullanarak haftada iki kez yarı-orta ölçekli değişimler gerçekleştirin. Kayıt yapmak için, sıcaklığı 1 santigrat dereceye ve karbondioksiti %37'e ayarlayarak ko-kültür 5. günden sonra mümkün olan en kısa sürede başlayın. Ardından, plakaları kayıt makinesine aktarın ve kayıttan önce en az beş dakika dengeleyin. Deneysel tasarıma bağlı olarak, her gün veya haftada bir 1 ila 15 dakika boyunca temel etkinliği kaydedin.