Bir Fare Serebral Endotelyumunda Hücre İçi Kalsiyum ve Membran Potansiyelinin Eş Zamanlı Ölçümü

Bir fare posterior serebral arterinin segmentlerini alın.

Hücreleri gevşeterek doku matrisini parçalamak için bir enzim çözeltisi ile inkübe edin.

Çözeltiyi bir tamponla değiştirin, ardından bir segmenti bir kayıt odasına aktarın.

Bağ dokusunu ve düz kas hücresi katmanlarını mekanik olarak ayırın ve alttaki endotel tüpünü izole edin.

Tüpü sabitleyin, ayrışmış katmanları çıkarın ve fizyolojik bir tampon ekleyin.

Odayı sürekli tampon akışı olan bir kayıt sistemine yerleştirin.

Endotel hücrelerine giren bir floresan kalsiyum indikatörü yerleştirin, ardından bir hücreye bir kayıt elektrodu yerleştirin.

Kalsiyum iyonu akışını tetikleyen ve endoplazmik retikulumdan kalsiyum salınımı için aşağı akış sinyalini indükleyen bir ilaç uygulayın.

İndikatör kalsiyuma bağlanır ve uyarıldığında floresan yayar.

Kalsiyum artışı, kalsiyuma bağımlı potasyum kanallarını aktive ederek potasyum çıkışına neden olur ve membran potansiyelini değiştirir.

Elektrot kullanarak floresan sinyali ve membran potansiyeli aracılığıyla hücre içi kalsiyumdaki değişiklikleri aynı anda kaydedin.

Bu prosedürde, bir mikroskop, bir kamera ve bir oda ve mikromanipülatörler tutan bir alüminyum sahne kullanarak öğütme aparatını hazırlayın. Bir mikroşırıngayı, sahneye ve numuneye bitişik bir pompa kontrolörü ile sabitleyin. Ardından, bir öğütme pipetini mineral yağ ile tamamen doldurun ve mikroşırınga pistonunun üzerine sabitleyin.

Ardından, pompa kontrolörlü mikroşırıngayı kullanarak, hava kabarcıklarının olmamasını sağlarken pipete yaklaşık 130 nanolitre ayrışma solüsyonu çekin. Daha sonra, sağlam arteriyel segmentleri, 10 mililitrelik bir cam tüpte gerekli enzim konsantrasyonları ile bir mililitre ayrışma çözeltisine yerleştirin.

Kısmi sindirim için 34 santigrat derecede 10 ila 12 dakika inkübe edin. Sindirimi takiben, enzim çözeltisini 5 mililitre taze ayrışma çözeltisi ile değiştirin. 1 mililitrelik bir pipet kullanarak, bir segmenti oda sıcaklığında ayrışma çözeltisi içeren hazneye aktarın.

Ardından, pipeti haznedeki ayrışma çözeltisine yerleştirin ve sindirilmiş kabın bir ucuna yakın bir yere yerleştirin. Nazik öğütme için pompa kontrol cihazında saniyede 2 ila 5 nanolitre aralığında bir hız ayarlayın. 100 kat ila 200 kat büyütme ile görüntülerken, bir endotel tüpü üretirken düz kas hücrelerini ayırmak için arteriyel segmenti geri çekin ve çıkarın.

Gerekirse, ayrışmış adventiti ve iç elastik laminayı endotel tüpünden ayırmak için dikkatlice ince uçlu forseps kullanın. Tüm düz kas hücrelerinin ayrıştığını ve sadece endotel hücrelerinin sağlam tüp olarak kaldığını onaylayın.

Mikromanipülatörler kullanarak, endotel tüpünün her iki ucunu borosilikat cam iğneleme pipetleri kullanarak süperfüzyon odasının cam lamel üzerine sabitleyin. Ayrışmış adventitia ve düz kas hücrelerini odadan yıkayın ve ayrışma çözeltisini iki milimolar kalsiyum klorür PSS ile değiştirin.

Endotel tüpüne sabitlenmiş mobil platformu süperfüzyon mikroskobu ve deney düzeneğine aktarın. Ardından, deney sırasında PSS ve ilgili ilaç çözeltilerinin sürekli olarak verilmesi için altı adet temiz 50 mililitrelik rezervuar kullanın.

Akış beslemesini vakumlu emişle eşleştirirken akış hızını laminer akışla tutarlı olarak manuel olarak ayarlamak için hat içi akış kontrol valfini kullanın. Arka plan verilerini ve boya yüklemesini kaydetmeden önce endotel tüpünün süperfüzyonu için en az beş dakika boyunca PSS'yi odaya verin.

Membran potansiyelini hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ile aynı anda ölçmek için keskin bir elektrot çekin ve Fura-2 boyası ile yüklü hücrelerden kayıt yapmak için iki molar potasyum klorür ile doldurun.

Boya transferi yoluyla hücreler arası eşleşmeyi incelemek için, mikroelektrodu iki molar potasyum klorür içinde çözünmüş% 0.1 propidyum iyodür ile doldurun. Ardından, elektrodu, bir mikromanipülatör ile sabitlenmiş bir elektrometre kafası aşamasına bağlı pipet tutucusunda klorürle kaplanmış gümüş bir telin üzerine yerleştirin.

Elektrotun ucunu odadaki akan PSS'ye kısa bir süre konumlandırmak için mikromanipülatörü kullanın ve dört kez objektiften görüntüleyin. Daha sonra, topraklanmış banyo potansiyeli ile tutarlı olarak dinlenme membranı potansiyelini sıfıra ayarlayın.

İstenirse, ses perdesini olası kayıtlarla ilişkilendirmek için elektrometrelere bağlı sesli temel monitörler kullanın. Daha sonra, 40 kat objektif kullanarak büyütmeyi 400 kata çıkarın ve elektrotun ucunu endotel tüpünün bir hücresinin hemen üzerine yerleştirin.

Yaklaşık 50 ila 80 endotel hücresine odaklanmak için fotometri yazılımını kullanarak fotometrik pencereyi ayarlayın. Ardından, mikromanipülatörü kullanarak elektrodu endotel tüpünün hücrelerinden birine nazikçe yerleştirin ve dinlenme zarı potansiyelinin stabilize olması için en az iki dakika bekleyin.

Dinlenme membran potansiyeli beklenen değerinde stabil hale geldiğinde, ışık yokluğunda floresan arayüzündeki fotoçoğaltıcı tüpü açın ve 510 nanometrede floresan emisyonu toplarken dönüşümlü olarak 340 ve 380 nanometrede heyecan verici Fura-2 ile hücre içi kalsiyum konsantrasyonunu elde etmeye başlayın.

Membran potansiyeli ve hücre içi kalsiyum konsantrasyonunun eşzamanlı ölçümleri yapıldıktan sonra, ilaçların uygulanmasından önce endotel tüpünün PSS ile sabit bir laminer akış hızında süper füzyonu için yaklaşık beş dakika bekleyin.

PSS'de hazırlanan ilacı sabit bir akış hızında süperfüzyon odasına uygulayın. İlaç tedavisi sırasında, F340 / F380 oranındaki membran potansiyelini aynı anda ölçün. Deney yapıldıktan sonra, elektrodu hücreden geri çekin. Ardından, membran potansiyeli ve hücre içi kalsiyum konsantrasyonunun ilgili kayıtlarını durdurun ve dosyaları veri analizi için kaydedin.