JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 2:17 dk. • July 8th, 2025
Oksijenli hücre dışı bir çözelti ile perfüze edilmiş bir kayıt odasına ko-kültür içeren bir lamel yerleştirin.
Ko-kültür, astrositlerden, bir floresan proteine kaynaşmış ışığa duyarlı iyon kanallarını ifade eden sıçan kortikal nöronlarından ve başka bir floresan proteini ifade eden iPSC'den türetilmiş nöronlardan oluşur.
Konfokal bir mikroskop kullanarak, floresan iPSC'den türetilmiş bir nöronu tanımlayın.
Tam hücre konfigürasyonu oluşturmak için hücre içi bir çözelti ile doldurulmuş bir kayıt pipetini nörona doğru ilerletin.
Doğru akım ölçümleri için sabit bir negatif membran potansiyelini koruyun.
Kortikal nöronlardaki ışığa duyarlı iyon kanallarını aktive etmek için ko-kültürü ışıkla aydınlatın, böylece bir aksiyon potansiyeli oluşturun.
Aksiyon potansiyeli, sinaptik yarığa nörotransmitter salınımına neden olur.
Sinaptik olarak bağlanırsa, nörotransmiterler yamalı iPSC'den türetilmiş nöron üzerindeki reseptörlere bağlanır, iyon kanallarını açar ve postsinaptik akımlar üretir.
Işık stimülasyonunu takiben iPSC'den türetilen nöronlarda artan postsinaptik akımlar, kortikal nöronlarla sinaptik bağlantıları doğrular.
60x suya daldırmalı lens ile donatılmış konfokal bir mikroskop kullanın. Hücreleri oda sıcaklığında, sürekli olarak% 95 oksijen,% 5 karbondioksit ile köpürtülmüş harici bir çözelti içinde perfüze edin. Kayıt mikropipetini doldurmak için dahili bir solüsyon kullanın.
Optogenetik stimülasyonu gerçekleştirmek için, tüm hücre modunda bir tdTomato-pozitif hücreyi yamalayın ve voltaj kelepçesini negatif 70 milivolta ayarlayın. Tüm alan cıva lambası ve 480'e 40 uyarma filtresi ile tüm alanı 30 saniye boyunca uyarın. ChR2 eksprese eden presinaptik kortikal nöronların fotostimülasyonu ile indüklenen yamalı bir hücrenin postsinaptik akımlarını veya PSC'lerini kaydedin.