JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 3:41 dk • July 8th, 2025
Anestezi uygulanmış, genetiği değiştirilmiş bir Drosophila melanogaster'ı yan tarafına bir lamel takın.
Ön ayaklarını uzatın ve tarsal segmentleri ortaya çıkarmak için sabitleyin.
Bu segmentler, kalsiyuma bağlı formda floresan veren kalsiyum indikatör komplekslerini eksprese eden tat nöronlarına sahiptir.
Çözeltiyi korumak için sineğin etrafına hidrofobik bir bariyer çizin.
Sineğin iyileşmesine izin verin ve nemlendirmek için açıkta kalan tarsal segmentlerin üzerine tamponlu bir tuzlu su çözeltisi yerleştirin.
Konfokal bir mikroskop altında, tarsal segmentleri gözlemleyin ve bir ön stimülasyon floresanı elde etmek için tat nöronlarını çeşitli derinliklerde görüntüleyin.
Segment üzerine lipofilik ligandlar içeren bir stimülasyon çözeltisi ekleyin.
Bu ligandlar, tat alma nöron reseptörlerine bağlanarak sinyal yollarını başlatır ve kalsiyum kanallarının açılmasını tetikler.
Bu, hücre dışı sıvıdan gelen kalsiyum iyonlarının sitoplazmaya girmesine ve kalsiyum gösterge komplekslerine bağlanmasına izin vererek floresan emisyonuna neden olur.
Tekrar gözlendiğinde, nöronal floresansta bir artış, ligand'a nöronal fizyolojik tepkiyi doğrular.
Sineği uyuşturduktan sonra, çok küçük bir damla şeffaf oje kullanarak 0.17 milimetrelik bir lamel üzerine tutturun. Tüm damlayı kullanarak sineğin yan tarafını slayda takın. Daha sonra, diseksiyon mikroskobu altında, sineğin ön ayağını uzatmak için ıslak bir boya fırçası kullanın. Ardından, iki çok ince bant şeridi kullanarak, birinci ve beşinci tarsal segmentleri lamel üzerine sabitleyin.
Hortumdaki nöronlar görüntülenecekse, labellumu ortaya çıkarmak için hortumun kürsüsünün üzerine başka bir ince bant şeridi yerleştirin. Şimdi, bir PAP kalemi kullanarak sineğin etrafına kısa bir duvar yapın. Ölçüm yapmadan önce anestezinin yarım saat geçmesine izin verin. Bu protokol için, PBST kullanarak mililitre başına 1 miligram stok ligand çözeltisinin gerekli seyreltmelerini hazırlayın.
Prosedüre başlamak için, 10 mikrolitre PBST'yi güvenli ve açıkta kalan tarsal segmentlere yerleştirin. Bu, bacağı nemlendirir ve odak dışına kaymasını önler. Ardından, bir sCMOS kameralı dönen disk konfokal mikroskop gibi hızlı zaman çözünürlüğü ile iyi bir floresan sinyali elde edebilen bir optik sistem kullanarak segmentlere odaklanın. Tarsal segmentte ilgilenilen nöronların üç ön stimülasyon Z-yığınını toplayın.
Bu örnekte, görüntüler 200 milisaniyelik pozlamalar ve her iki saniyede bir 6 mikron x 1/2 mikronluk bir bölüm üzerinde 2'ye 2 gruplama ile yakalanır. Yüksek bir sinyal-gürültü oranına izin verirken, foto ağartmayı en aza indirmek için lazerin gücünü optimize ettiğinizden emin olun. Burada, 491 nanometre, 100 miliwatt'lık bir lazer% 30 iletimde çalıştırılır.
Sinyal, stimülasyondan önce algılanabilir olmalı, ancak doygunluğa yaklaşmamalıdır. Şimdi, 10 mikrolitre stimülasyon solüsyonunu ilgilenilen tarsal segmente pipetleyin. Pipetleme sırasında bacağa veya sineğin vücudundan herhangi birine dokunmaktan kaçınmaya çok dikkat edin, aksi takdirde tarsi yerinden çıkacaktır. Ardından, hemen ilk stimülasyon sonrası görüntüleri alın ve floresandaki maksimum değişikliği belgelemek için yeterli görüntü toplamaya devam edin.