JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 2:43 dk. • July 8th, 2025
Drosophila larvaları ile başlayın, açıkta kalan kas ve sinir lifleri, floresan membran boyası veya FM boyası vezikülleri içeren bir çözeltiye batırılır.
FM boyası, hücre zarındaki lipitlere bağlanarak üzerinde floresan bir kaplama oluşturur.
Bir mikromanipülatör ünitesi kullanarak, emme mikroelektrot ucunu mikroskop altında konumlandırın.
Sinir liflerine ve mikroelektroda odaklanın.
Sinir lifinin bir halkasını mikroelektroda emmek için negatif basınç kullanın.
Sinir lifini uyarmak için akım darbeleri uygulayın.
Bu, sinaptik vezikül endositozunu başlatmak için bir motor nöronun bir kas lifine bağlandığı nöromüsküler kavşağı tetikler.
Bu işlem sırasında hücre, nörotransmisyonun presinaptik aşamalarını görselleştirmek için ideal olan lekeli endositik veziküller oluşturmak için FM boya kaplı zarı yutar.
FM boyasını yıkayın ve harici solüsyonu değiştirin.
FM boya lekeli vezikülleri hücreden boşaltmak için akım darbeleri uygulayın.
Elektriksel stimülasyon için, gerekli konik ve uç boyutunu elde etmek için mikroelektrot çektirmesini kullanarak bir emme pipeti hazırlayın. Daha sonra, tek bir motor sinirini emerken sıkı bir uyum sağlamak için mikroelektrot ucunu bir mikro dövme ile ateşle parlatın.
Emme pipetini, uzun, esnek bir plastik tüpe ve bir şırıngaya bağlı bir mikromanipülatör üzerindeki elektrot tutucusuna kaydırın. Daha sonra, FM boya ile preparasyonu mikroskop aşamasına koyun ve larva ve emme pipeti odaklanana kadar sahneyi kaldırın.
Daha sonra, şırınga tarafından üretilen negatif hava basıncı ile seçilen yarım segmentini emme elektroduna innerve ederek bir kesme motor siniri halkasını emdirin. Daha sonra, SV endositozunu ve FM1-43 boya alımını sağlamak için seçilen parametreleri kullanarak motor siniri uyarın.
Prosedürün bu noktasındaki en kritik adım, tek bir motor aksonunu emme elektroduna sıkı bir şekilde emmektir. Bu biraz deneme yanılma gerektirebilir. Yeterli bir emme elektrodu bulunduğunda, tutarlı bir stimülasyon gücü sağlamak için karşılaştırılan tüm koşullar için aynı olanı kullanın.
FM boya boşaltma için, aynı motor siniri aynı elektroda emdirin ve ardından SV ekzositozunu ve FM1-43 boya salınımını aktive etmek için motor siniri uyarın.