JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 2:42 dk • July 8th, 2025
Kalsiyum içermeyen salin içeren bir kayıt odasına canlı bir Drosophila larva nöromüsküler preparat yerleştirin.
Larva nöronları, ışığa duyarlı bir katyon kanalını ifade eder.
Floresan boya içeren kalsiyum katkılı tuzlu suya geçin.
Boya, içselleştirilmemiş durumda zayıf bir şekilde floresan olur, ancak nöronlar tarafından içselleştirildiğinde güçlü bir şekilde floresan olur.
Larvaları mavi ışıkla aydınlatın.
Bu, kanalı aktive eder, katyon akışını ve nöron depolarizasyonunu indükleyerek bir aksiyon potansiyeli başlatır.
Aksiyon potansiyeli, nöromüsküler kavşaktaki sinaptik terminale ulaşır ve kalsiyum akışına ve vezikül ekzositozuna izin verir.
Daha sonra, boyaya bağlı membran, vezikül geri dönüşümü sırasında içselleştirilir.
Vezikül geri dönüşümünü durdurmak ve içselleştirilmemiş boyaları çıkarmak için kalsiyum içermeyen tuzlu su ile yıkayın.
Floresan sinyalini görselleştirin.
Ardından, boya içermeyen kalsiyum eklenmiş tuzlu su ekleyin ve tekrar aydınlatın.
Bu, başka bir aksiyon potansiyeli, kalsiyum akışı ve boya içeren vezikül ekzositozunu indükler.
Sinyali tekrar görselleştirin.
Vezikül ekzositozuna bağlı boya salınımı, vezikül içselleşmesi sırasındaki duruma kıyasla floresansı azaltır.
Channelrhodopsin stimülasyonu için, bir koaksiyel kablo kullanarak programlanabilir bir stimülatöre mavi bir LED takın ve LED'i kamera bağlantı noktasına yerleştirin. Mikroskop Yakınlaştırma işlevini kullanarak mavi LED ışık huzmesini FM boyası ile preparatın üzerine odaklayın.
Prosedürün bu noktasındaki en kritik adım, LED ayarlarının sabit tutulduğundan ve tutarlı bir stimülasyon gücü sağlamak için tüm koşullar karşılaştırıldığında her bir hayvanın aynı bölümünü aydınlattığınızdan emin olmaktır.
Işık stimülasyonunu başlatın ve optogenetik stimülasyon süresinin önceden belirlenmiş süresi boyunca zamanlayıcı ile takip edin. Zamanlayıcı durduğunda, FM boya solüsyonunu hızlı bir şekilde çıkarın ve SV döngüsünü durdurmak için kalsiyum içermeyen tuzlu su ile değiştirin. FM boya boşaltma için, ışık stimülasyonunu başlatın ve optogenetik stimülasyon süresinin önceden belirlenmiş süresi boyunca zamanlayıcı ile takip edin. Zamanlayıcı süresi sona erdiğinde, FM boya solüsyonunu hızlı bir şekilde çıkarın ve SV döngüsünü durdurmak için kalsiyum içermeyen tuzlu su ile değiştirin.