Sağlam Sıçan Dorsal Kök Gangliyonlarında Tüm Hücre Yama Kelepçesi Kayıtları

ACS ile perfüze edilmiş bir kayıt odasında hareketsizleştirilmiş sıçan dorsal kök gangliyonlarını veya DRG'yi alın.

DRG, uydu glial hücrelerle çevrili duyusal nöronlar içerir.

Hücre içi çözelti ile doldurulmuş ve bir amplifikatöre bağlı bir yama pipetine pozitif basınç uygulayın, ardından hedef nörona doğru ilerletin.

Pozitif basınç, çevredeki uydu glial hücre tabakasını geçmeye ve nöronla temas etmeye yardımcı olarak zarı üzerinde bir girinti oluşturur.

Membran ile sıkı bir sızdırmazlık oluşturmak için negatif basınç uygulayın.

Ardından, tüm hücre konfigürasyonunu oluşturmak için negatif basınç darbeleri uygulayın. Doğru sinyal ölçümleri için amplifikatör parametrelerini kalibre edin.

Nöronun uyarılabilirliğini belirlemek için, nörona kısa artımlı akımlar uygulayın, voltaj kapılı iyon kanallarını açın ve bir aksiyon potansiyelini tetikleyin.

Bir aksiyon potansiyelini tetiklemek için gereken minimum akım olan reobazı ölçün.

Ayrıca, aksiyon potansiyelinin meydana geldiği minimum membran potansiyelini ölçmek için bir rampa akımı uygulayın.

Bu prosedürde, bozulmayı önlemek için elektrot çözeltisini buzun üzerine yerleştirin. Ardından, cam yama pipetini filtrelenmiş hücre içi çözelti ile doldurun. Ardından, pipeti baş aşaması pipet tutucusuna yerleştirin.

Pipeti banyo solüsyonuna indirmeden önce pistonu yaklaşık 1 mililitre yerinden çıkararak 5 mililitrelik bir şırınga aracılığıyla pipete hafif pozitif basınç uygulayın. Ardından, amplifikatörde V-kelepçe modunu seçin ve yazılımda membran test arayüzünü açın.

Mikroskop altında, pipeti hedef nörona yaklaştırın. Daha sonra, nöron ile çevresindeki uydu glial hücre tabakası arasında ani bir boşluk genişlemesi gözlenene kadar uydu glial hücre tabakasını geçmek için pipetten pozitif basınç uygulayın. Ardından, nöron üzerinde bir çukur görülene kadar pipeti nörona doğru hareket ettirmeye devam edin.

Hazırlığımızda, nöronlar uydu glial hücrelerle çevrilidir. Bu nedenle, glial hücre katmanlarına nüfuz etmek ve tek tek nöronlara ulaşmak için, kayıt pipeti yüksek bir pozitif basınçta tutulur.

Bundan sonra, pozitif basıncı azaltın. Nazik emiş ile bir gigaohm conta elde edin.

Tüm hücre kayıt konfigürasyonunu elde etmek için, kısa ama güçlü emme yoluyla nöron hücre zarına nüfuz edin.

Alternatif olarak, emme uygulanırken amplifikatör üzerindeki zap işlevini kullanın.

Bir tam hücre modu kurulduktan sonra, amplifikatör üzerindeki kapasitans ve direnç kompanzasyon düğmelerini çevirerek tüm hücre kapasitansını ve seri direnci telafi edin. Ardından, membran test penceresini kapatın. I-cl'yi seçinampamp üzerindeki mod düğmesini çevirerek normal mod.

Daha sonra, tıklayın Protokolü aç yazılımda. Reobaz ölçümü için protokolü seçin ve yükleyin ve kaydı başlatmak için Kaydet'e tıklayın. Nöronal uyarılabilirliği incelemek için, 100 pikoamperlik adımlarla kademeli bir dizi depolarize edici akım enjekte ederek giriş direncini ve reobazı ölçün.