Fare Kokleasının Belirli Frekans Bölgelerinde Şerit Sinapslarının Değerlendirilmesi

Spesifik olmayan etkileşimleri önleyen bir geçirgenleştirici ajan ve bir bloke edici ajan ile önceden işlenmiş fare koklear dönüşleri içeren tüplerle başlayın.

Her dönüş farklı ses frekanslarını algılar ve sesi elektrik sinyallerine dönüştüren saç hücreleri içerir. Bu sinyaller, şerit sinapslarındaki nörotransmiterler aracılığıyla işitme sinirine iletilir.

Solüsyonu çıkarın ve şerit sinapslarında saç ve sinir hücrelerindeki proteinlerle etkileşime giren birincil antikorları ekleyin, ardından yıkayın.

Birincil antikorlarına bağlanan kırmızı ve yeşil floroforlarla etiketlenmiş ikincil antikorlarla inkübe edin.

Bağlanmamış ikincil antikorları çıkarmak için yıkayın.

Numuneyi, çekirdekleri maviye boyamak için nükleer boya içeren bir montaj ortamına sahip bir cam slayt üzerine yerleştirin.

Lameli monte edin. Kurutun, ardından her bir segmenti çeşitli derinliklerde görüntülemek için konfokal bir mikroskop kullanın.

Şerit sinapsları, yakın konumlandırılmış kırmızı ve yeşil punkta olarak görünür.

Ses frekansına tepkilerini ilişkilendirmek için bu işlevsel noktaları her turda sayın.

Diseksiyondan sonra, her bir koklear dönüşü ayrı ayrı 2,5 mililitrelik santrifüj tüplerine yerleştirin. Bir döndürücü üzerinde oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 0.1 Triton X-100'de PBS'de% 10 keçi serumu ile spesifik olmayan herhangi bir bağlanmayı bloke edin.

İnkübasyonun sonunda, çözeltiyi diseksiyon mikroskobu altında çıkarmak için 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın. Örnekleri, PBS'de% 5 keçi serumu ve% 0.1 Triton X-100 içinde bir döndürücü üzerinde gece boyunca 4 santigrat derecede seyreltilmiş birincil antikorlarla inkübe edin.

Ertesi sabah, kalıntı primer antikoru çıkarmak için doku örneklerini yıkama başına soğuk 0.1 molar PBS ile 5 dakika boyunca üç kez durulayın. Daha sonra, numuneleri PBS'de% 5 keçi serumu ve% 0.1 Triton X-100 içinde seyreltilmiş uygun ikincil antikorlarla döndürücü üzerinde oda sıcaklığında iki ila üç saat boyunca, ışıktan korunarak etiketleyin.

İnkübasyonun sonunda, numuneleri gösterildiği gibi 0.1 molar PBS ile üç kez yıkayın ve numuneleri 0.1 molar PBS içeren ayrı ayrı 35 milimetrelik plakalara aktarın. Slaytın üzerine bir damla DAPI takviyeli montaj ortamı yerleştirin ve numuneleri PBS'den montaj ortamına aktarın. Her bir lamel üzerine bir lamel yerleştirin ve lamellerin yavaşça düşmesini sağlamak için bırakın. Ardından, slaytları gece boyunca 4 santigrat derecede bir slayt kutusunda kurutun.

Numuneleri görüntülemek için uygun lazerlere sahip konfokal bir mikroskop ve 63x yüksek çözünürlüklü yağa daldırma lensi kullanın. Her koklea dönüşünden 8 mikrometre konfokal z-yığınları elde etmek için. Sinaptik punktum sayıları için, z-yığınlarını 0.3 mikrometre adım boyutuyla iç saç hücrelerinin tüm uzunluğunu kapsayacak şekilde ayarlayın, tüm sinaptik punktaların görüntülenebildiğinden emin olun ve punkta içeren görüntüleri bir yığında birleştirin z ekseni projeksiyonunu elde etmek için.

Birleştirilen görüntüleri uygun bir görüntü işleme yazılım programına aktarın. Her hücre için sinaptik punkta sayısını hesaplamak için belirli frekans bölgelerindeki her bir z-yığınındaki sinaptik toplam sayıları DAPI pozitif iç saç hücrelerinin sayısına bölün. Her spesifik frekans bölgesinde, 9 ila 11 iç saç hücresi içeren farklı mikroskobik alanların 3 görüntüsündeki tüm sinaptik punktaların ortalamasını alın.

Hücre iskeleti mimarisini ve sinaptik lokalizasyonu daha iyi görselleştirmek için, tek tek iç saç hücrelerinin sinaptik yapısını ve dağılımını görsel olarak değerlendirmek için fırça aracını kullanın. Presinaptik şeritlerin ve postsinaptik reseptör yamalarının yan yana dizilişini incelemek için, şeritlerin etrafındaki voksel alanını çıkarmak için dikdörtgen seçim çerçevesi aracını kullanın ve tek tek şeritleri izole etmek için görüntü kesmeyi kullanın. Ardından, bu minyatür projeksiyonların eşleştirilmiş sinapsları ve yetim şeritleri tanımlamak için kullanılabilecek bir küçük resim dizisini elde etmek için Görüntü ve Görüntü Boyutu'nu tıklatın.