Name: Nöral Tüp Kapatma Fare Tüm Embriyo Kültürü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Öğrenin fare embriyolarında nöral tüp kapanışını izlemek için tam embriyo kültürü yöntemini. Bu teknik, gelişimsel biyoloji ve nöral tüp defektleri araştırmalarında farmakolojik müdahale olanakları sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A. Hadjantonakis (Sloan-Kettering Enstitüsü) ve L. Niswander (Colorado-Denver U) laboratuvar laboratuar Biz diseksiyonu ve kültür teknikleri ile yararlı öneriler için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, L. Niswander ve J. Nadeau (Sistem Biyolojisi Enstitüsü) ile işbirliği içinde MER&#39;e JDG ve RO1NS05897 NRSA NS059562 tarafından desteklenmektedir.

1. Kültür ortamının hazırlanması - Tüm reaktifler Tablo 1'de yer alan <ol><li> 37 çözülme erkek sıçan serum ° C </li><li> 30 dakika için 55 sıçan serum Isı İnaktivasyon ° C </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika 10K Santrifüj sıçan serum </li><li> Fenol-kırmızı ücretsiz DMEM w / Yüksek Glikoz supernatant ve karıştırın 50:50 çıkarın </li><li> 0.45 um şırınga filtresi kullanarak medya sterilize </li><li> Medya / embriyonun en az 1ml hazırlanmalıdır </li></ol> 2. Hamile baraj rahim izolasyonu <ol><li> Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış prosedürlerini kullanarak, hamile baraj ilk anestezi ve sonra servikal dislokasyon ile sakrifiye </li><li> Karın% 70 EtOH ile sterilize </li><li> Büyük forseps ile sadece meme çizgi üstü, orta hat boyunca küçük bir deri yolu sıkın ve büyük bir makas ile forseps altındaki karın açmak. Herhangi bir iç yapıya zarar vermemek için dikkatli oluns </li><li> Tüm karın açık olduğu için, farenin her iki tarafa doğru ilk açılışında yanal kesmek için makas kullanın. </li><li> Bağırsaklar ve aşırı yağ pedler genellikle rahim belirsiz olabilir ve bu rahim ve yumurtalıkların üst her iki tarafında görülebilir, böylece kenara hareket ettirilmelidir </li><li> Yumurtalıklar altında rahim üst sıkın ve rahim rahim bir ucundan diğer yumurtalık kesme, yağ ayırmak için makas kullanmak </li><li> Petri kabındaki tuzlu su ile forseps ve yeri ile rahim dışına kaldırın </li></ol> 3. Embriyolar rahim çıkarılması <ol><li> Herhangi bir aşırı kan kaldırmak ve dışarıdan herhangi bir aşırı yağ kırpmak için, tuzlu su ile rahim durulayın </li><li> Oda sıcaklığında temiz bir çanak aktarın. Görselleştirme artırmak için tuzlu Tyrodes </li><li> Bir stereomikroskopta kullanarak, dikkatli rahim dışında kabuğu, küçük bir makas ya da gerekli para cezası (# 5) forseps ya kullanarak her bir embriyo ayırın. </li> &lt;li&gt; delmek embriyo dikkatli olmak, rahim duvarı ve desidua arasındaki boşluğa ve rahim duvarına geri kabuğu ince forseps Ekle </ol> 4. Embriyolardan desidua kaldırılması <ol><li> Orient desidua karanlık bölümü (plasenta) size dönük olduğunu </li><li> Forseps ile hafif kısmı desidua karanlık bölümünü birbirinden ayıran hat boyunca bir kesi yapmak çok derin kesmek için dikkatli olmak, </li><li> Ectoplacental konisi (EPC) gözyaşı dikkatli olmak, yolk kesesi üst plasenta ayrılması tamamlayın. Bu noktada yolk kesesi Reicherts zarı görselleştirmek için gerekir </li><li> (Hafif kısmını) delmek sarısı kesesi dikkatli olmanın tüm desidua kaldırmak için devam edin </li><li> Yavaşça çimdik ve EPC uzak soyma tarafından Reicherts kaldırmak. EPC hasarlı veya yolk kesesi ayrılmış ise, embriyoların normal E8.5-E9.5 açmak için başarısız olur </li><lireicherts kald ile embriyo yolk kesesi kolayca g ve sayma somities taraf sahnelenen olabilir.></lireicherts></ol> 5. Kültür sistemi kurmak <ol><li> Bir embriyo, yolk kesesi zarar vermeden pipetlenebilir böylece açılması çapını artırmak için makas ile plastik bir transfer pipet ucu </li><li> Medya embriyo ortalama 1 ml temiz silindir şişe doldurun. 3-6 embriyo en fazla kullanılan silindir şişe türüne bağlı olarak, her bir şişe yüklenebilir. </li><li> Medya dolu silindir şişe kesim pipet kullanarak mümkün olduğunca az Tyrodes olarak üzerinde taşıyan embriyolar olarak medya sulandırmak için aktarma </li><li> Kauçuk, cam rulo şişe üst fişini takın (tapa) </li><li> Böylece sıkı bir mühür, fiş ve tambur arasında oluşan silindir kültür davul içine silindir şişe yerleştirin </li><li> Tüm şişeleri bir kez takıldıktan ve davul herhangi bir boş yuva w mühürlü edilmiştiri. lastik tıpa, rulo etkinleştirin </li><li> CO 2 ve O 2 tank açın ve böylece çıkış vanası saniyede bir kabarcık bırakmadan, yaklaşık 2 psi ayarlayabilirsiniz. E8.5-E10 embriyolar için,% 20 O 2 ve% 5 CO 2 kullanılmalıdır. </li><li> Inkübatör 37 ayarlanmış olduğundan emin olun ° C ve kapağı veya embriyolar ışıktan korumalı olduğu için inkübatör yakın. </li><li> Embriyolar, somities Ayrıca, ilerlemesi dönüm ve nöral tüp kapanması ölçüde onların gelişimini değerlendirmek için periyodik olarak kontrol edilmelidir </li><li> 2-3 saat sonra kültür, medya farmakolojik inhibitörleri ya da diğer tedaviler eklenebilir </li><li> Çalışmanın tasarımı, araç veya çalışma reaktifi inaktif analogları gibi kontroller, içermelidir. </li></ol> 6. Bütün embriyo kültür sonraki gelişimi değerlendirilmesi <ol><li> Gazı kapatın, rulo durdurmak, ve inkübatör şişe kaldırmak </li><li> Transferi embriyolar geri Tyrodestereomicroscope altında değerlendirilmesi için bir Petri kabındaki veya PBS </li><li> Yolk kesesi&gt; 120 dakika başına atışlarda ve dolaşım belirgin olmalı, bir kalp atışı görünür ve kalp hızı olmalı, balon gibi görünmelidir </li><li> Fotoğraf embriyolar önce yolk kesesi kaldırılması için gerekirse </li><li> EPC yakın bir delik kesme ve embriyonun baş ve kıç üzerine yumurta sarısı kesesi ve amniyon saygısız embriyo yolk kesesi çıkarın. </li><li> Yolk kesesi embriyo ayrı kesilmiş göbek kordonu ve yolk kesesi embriyo gerekirse genotipleme için kullanılabilir. </li><li> Hücre gruplarının sayısı ve açık kafatası kıvrımları, yüz ve / veya açık bir kaudal neuropore eksik kapatılması gibi nöral tüp defekti, embriyo inceleyin. Çok morfogenetik değişiklikleri Theiler sınıflandırma (göre sahnelenen Embriyolar olabilir <a href="http://genex.hgu.mrc.ac.uk/Databases/Anatomy/MAstaging.html">eMap / anasayfa.html http://www.emouseatlas.org/</a> Tekrar), fotoğrafik bir rekorembriyo gelişimi yararlıdır. </li></ol> 7. Notlar <ol><li> Herhangi bir nick veya yolk kesesi gözyaşları başarılı dönüm önlemek ve normal gelişimini engeller, çünkü yüksek kaliteli diseksiyonu esastır. EPC Reichert membran (RM) çıkarılması sırasında zarar ve EPC kısmen de olsa yolk kesesi ayrılmış ise, embriyoların normal gelişmez. Ancak, RM eksik kaldırma embriyolar veya RM hücreler kültür ortamında büyümek ve yolk kesesi genişlemesi, her ikisi de normal gelişimini önlemek sıkmak birbirine yapışmasına ve / neden olabilir. </li><li> Temiz ve keskin bir forseps, mat ya da katlanmasını forseps prosedür çok daha zor hale getirir, çünkü iyi bir diseksiyon almak için gizli. Enstrümanlar Protein yatakları, doku hasarına yol açacaktır. </li><li> Temiz, steril cam şişeler de embriyolar yan duvarına yapışmasını ve zarar görmesini önlemek için gereklidir. Deney başlamadan önce, şişeler scr olmalıdır, ubbed dH 2 O sabun ve su ile durulanır, ve her şişede su kaynar kadar küçük bir miktar su ile mikro. Şişeler, daha sonra% 70 EtOH ile durulanır ve kuru hava için izin verilir. </li><li> Embriyo kültür ortamları ne kadar erken transfer edilebilir ve 37 ° C daha iyi sağkalım geri ısındı çünkü, mümkün olduğunca çabuk çalışın. </li><li> Her embriyo zaman aynı miktar için herhangi bir embriyonun büyüme farklılıklar yaratarak önlemek için oda sıcaklığında, böylece silindir şişe herhangi bir embriyolar transfer olmadan önce tüm çöp diseksiyon tamamlayın </li><li> Kültürleri bakteriyel kontaminasyonu önlemek için steril bir ortam sağlama. Bizim kültür deneyler antibiyotik yapılır ama bakteri gelişimini engellemek için birçok laboratuvar medya antibiyotik eklemek var. Deneyin başında olduğu gibi orta deney sonunda net olarak görünür. Medya bulutlu haline gelmiştir veya görünür bir çökelti varsa, con muhtemeldir.kültür bulaşmış tamination. </li><li> Etkisiz gaz alışverişi embriyoların gelişimi geciktirebilir, bu nedenle sürekli olarak yayınlanmasını sağlayacak güvenilir bir düzenleyici olduğundan emin olabilirsiniz. </li><li> Embriyolar ex vivo kültür yaklaşık% 50 daha yavaş gelişir, bu nedenle deney tamamlanması için uygun gelişme aşamasına ulaşmış olmasını sağlamak için Somitlerin saymak esastır. </li></ol> 8. Temsilcisi sonuçları: Embriyoların görünümü öncesi ve sonrası rulo kültürü Şekil 1'de gösterilmiştir. Diseksiyon zamanda, embriyolar, kuyruk, baş kıvrımları arkasında bir bütün yolları yapılandırma (Şekil 1A, D) olmalıdır. Kültür ortamında 36 saat sonra, embriyolar kuyruk başın önünde (Şekil 1B, C, E, F) C-eğri, cenin pozisyonunda olduğunu dönüm tamamlanmış olması gerekir. Farmakolojik manipulasyon sırasında yakınsak uzantısı bilinen bir inhibitörü RhoA kinaz inhibitörü (Y-27.632)neurulation (Ybot-Gonzalez, 2007), embriyo ve rostral-kaudal ekseni boyunca (Şekil 1E, F) kranial sinir kat kapatılması engeller bir kısalma sonuçları. Bizim verilerimiz, kademeli olarak artan dozlarda Y-27.632 kafatası kat kapatılması bozar (Şekil 2A) ve mansap RhoA kafatası neurulation ve yakınsak uzatma sinyali rolü ile tutarlı vücut ekseni (Şekil 2B) kısaltır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3132/3132fig1.jpg"> Şekil 1 farmakolojik inhibitörü Y-27.632 ile kültürler embriyoların ve manipülasyon görünümü. Önce (A, D) bütün embriyo kültürü E8.5 Dissected embriyolar (B, E) yolk sac rulo kültür 36hrs hala bozulmamış, sonraki E10 Embriyolar. (C, F) yolk kesesi, başarılı torna ve nöral tüp kapanması göstermek için kaldırıldı. Rho kinaz inhibitörü Y-27.632 (E, F) ile tedavi edildi Embriyolar geçmesi ve düzgün yakınsak uzatma göstermek için başarısız oldukısaltılmış bir vücut ekseni. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3132/3132fig2.jpg"> Şekil 2. kranial nöral tüp kapanması ve eksen uzama RhoA kinaz inhibitörü etkisi. (A) Y-27.632 doz yüzdesi (% NTC = yüzde nöral tüp kapanması) kafatası kıvrımları başarıyla kapatmak için mümkün olan embriyoların karşılaştırıldığında kültür ortamı ekledi. (B) otik vezikül ve ön ayakları arasındaki mesafe, artan dozlarda Y-27.632 (p &lt;.05) önemli ölçüde azalmıştır.

<ol><li>Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCockroft%2C+DL+%22Mammalian+Postimplantation+Embryos+A+Practical+Approach%22">Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach</a>. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. (1990).</li>
<li>Gray, J. D., Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+folate+supplementation+from+Crooked+tail+and+other+NTD-prone+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res.+A.+Clin.+Mol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into folate supplementation from Crooked tail and other NTD-prone mutant mice.</a> Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 85, 314-321 (2009).</li>
<li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufman%2C+MH+%22The+Atlas+of+Mouse+Development%22">The Atlas of Mouse Development</a>. , Academic Press Limited. San Diego. (1992).</li>
<li>Ybot-Gonzalez, P., Savery, D., Gerrelli, D., Signore, M., Mitchell, C. E., Faux, C. H., Greene, N. D., Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+extension%2C+planar-cell-polarity+signalling+and+initiation+of+mouse+neural+tube+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Convergent extension, planar-cell-polarity signalling and initiation of mouse neural tube closure.</a> Development. 134, 789-799 (2007).</li>
<li>Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-environment+interactions%2C+folate+metabolism+and+the+embryonic+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Syst+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Gene-environment interactions, folate metabolism and the embryonic nervous system.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2, 471-480 (2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Embriyo gelişimi sırasında içsel anne, intrauterin faktörler ayrı yetenek embriyogenez tüm aşamalarında eğitim için önemli bir araçtır. İşte biz böylece ilacın anne metabolizma değişken çıkarırken kafatası neurulation ex utero RhoA kinaz küçük bir moleküldür inhibitörü olan etkilerini analiz ettik. Bu farmakolojik manipülasyon, kafatası neurulation ve yakınsak uzantısı üzerinde derin bir etkisi vardır. Bu bileşiğin Duyarlılık farklı genetik fare mutantlar arasında mukayese edilebilir. Burada sunulan yöntem, diğer moleküler geliştirme yollarının çalışmalar, çeşitli reaktifleri kullanılarak embriyolar hücresel fonksiyonunun doğrudan manipülasyon izin de uygulanabilir olabilir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Isim </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Diseksiyon için stereomikroskopta </td><td> Leica </td><td> M165 </td><td></td></tr><tr><td> Hassas İnkübatör </td><td> BTC Mühendisliği (UK) </td><td> BTC 001 </td><td></td></tr><tr><td> Döner Şişe Kültür Birimi </td><td> BTC </td><td> BTC 003 </td><td></td></tr><tr><td> Birimi Döner Cam Şişe </td><td> BTC </td><td> BTC 005 </td><td></td></tr><tr><td> Silikon Kauçuk Bung </td><td> BTC </td><td> BTC 007 </td><td></td></tr><tr><td> Silikon Kauçuk Cork </td><td> BTC </td><td> BTC 008 </td><td></td></tr><tr><td> Gaz bubbler Inlet </td><td> BTC </td><td> BTC 012 </td><td></td></tr><tr><td> Gaz bubbler Giriş Tuzak </td><td> BTC </td><td> BTC 013 </td><td></td></tr><tr><td> Gaz bubbler Outlet </td><td> BTC </td><td> BTC 014 </td><td></td></tr><tr><td> Tüp </td><td> TechAir </td><td></td><td> % 20 O 2,% 5 CO 2 </td></tr><tr><td> Gaz Regülatörü </td><td> TechAir </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Erkek Rat Serum </td><td> Harlan Labs </td><td> 4520 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM w / o fenol kırmızısı </td><td> Invitrogen </td><td> 31053 </td><td></td></tr><tr><td> 10 ml Şırınga </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> Şırınga Filtre </td><td> Nalgene </td><td> 190-2545 </td><td></td></tr><tr><td> Büyük Diseksiyon Makas (künt ucu) </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td><td></td></tr><tr><td> Ekstra Güzel Bonn Makas </td><td> Güzel Bilimsel İşlem Araçları (FST) </td><td> 14084-08 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Dumot # 5 forseps </td><td> FST </td><td> 11252-50 </td><td></td></tr><tr><td> Tyrode Kullanıcı Tuzlu </td><td></td><td></td><td> Cockroft 1990 yılında açıklanan </td></tr><tr><td> 10 cm Tek Kullanımlık Petri Dish </td><td> BD </td><td> 351029 </td><td></td></tr></tbody></table>

nöral tüp kapatma fare tüm embriyo kültürü

Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture

Genetik fare modelleri memeli nöral tüp kapanması çalışmada önemli bir araçtır (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010). Ancak, in utero çalışmada fare embriyo doğrudan farmakolojik ilgi reaktif anne metabolizma etkileri izolasyon embriyoların işlemek için yetersizlik ile sınırlıdır. Onları embriyo ulaşmasını engel olabilecek vücut savunma çeşitli diyet yoluyla ya da enjeksiyon yoluyla, küçük bir molekülü, rekombinant protein veya siRNA, bu maddelerin anneye teslim olsun bu kararsız bileşikler tabi olacaktır. Bütün embriyolar kültürlerini geliştirme içsel fetal etkilerinin anne ayrı soruşturmalar kullanılabilir. Burada, Diseksiyon sonra normal nöral tüp kapanması (Crockett, 1990) için izin veren bir rulo inkübatör cihazları zenginleştirilmiş medyayı kullanarak kültür fare embriyoları için bir yöntem sunuyoruz. Kültür, embriyolargeleneksel embriyoların hala in utero, aksi takdirde mümkün olmazdı in vitro teknikleri kullanarak manipüle edilebilir. Embriyo kardeşler (kranial ve kaudal kat neuropore sonuca E9.5-10 E7-7.5 oluşan neurulation (neurulation başlangıcından hemen önce nöral plak oluşumu,) farklı yönlerini incelemek için çeşitli zaman noktalarında toplanan olabilir kapatılması, Kaufman, 1992). Bu protokol, kranial neurulation çalışma için en uygun timepoints embriyolar diseksiyon yöntemi göstermektedir. Embriyolar, nöral tüp kapatma başladıktan sonra değil, öncesinde embriyo torna ve kranial sinir kat kapatılması, E8.5 (yaklaşık 10-12 somities) disseke ve E10 (26-28 somities) kadar kültürünü muhafaza olacak, kranial neurulation tamamlanmış olmalıdır.

Anne metabolizma atlar neurulation sırasında, fare embriyo doğrudan farmakolojik manipülasyonu için izin veren bir yöntem açıklanmıştır. Bu teknik, zaman noktası ve farmakolojik ajan değişen neurulation farklı yönlerini incelemek için adapte edilebilir.

Nöral Tüp Kapatma Fare Tüm Embriyo Kültürü

Genetik fare modelleri, memeli nöral tüp kapanmasının incelenmesinde önemli bir araçtır (Gray & Ross, 2009; Ross, 2010). Ancak, farelerin incelenmesi...

Bu prosedürün genel amacı, koşulların tanımlanabildiği uterus dışı bir ortamda, fare embriyosunun nöral eksen uzaması ve nöral tüp kapanması olaylarını izlemektir. Bu işlem, öncelikle gestasyonel veya embriyonik gün 8,5'teki anestezi altındaki gebe fareden uterus boynuzlarının çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, tekil fare embriyoları, vitellus keseleri sağlam ve desiduanın büyük bir kısmı ile birlikte uterustan çıkarılır.Ardından, ekto-plasental koni sağlam bırakılarak ekstra embriyonik decidua dokusu budanır. Prosedürün son adımı, embriyoların vitellinus keseleriyle birlikte, test edilen farmakolojik ajanların bulunduğu veya bulunmadığı ortamları içeren roller şişelere aktarılması ve embriyoların sürekli gaz akışının olduğu bir inkübatörde 18 ila 24 saat boyunca kültüre edilmesidir. Nihayetinde; somitlerin aşamalı eklenmesini, nöral kıvrımların karşılıklı gelmesini ve embriyonun dönerek fetal pozisyonun tanıdık c kıvrımına girmesiyle kapanmasını gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu yöntem, normal nöral tüp kapanmasında hangi moleküler yolakların rol oynadığı gibi alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Özellikle nöral tüp defektlerine veya NTD'lere yatkınlık sağlayan genetik mutasyonlar taşıyan embriyolarda, normal oluşumu desteklemeye yardımcı olabilecek ajanlar veya takviyeler nelerdir. Diseksiyon basamakları oldukça zorlayıcı olabildiği için, bu tekniğin görsel olarak gösterimi kritik öneme sahiptir.Embriyolar küçüktür ve kolayca hasar görebilirler; vitellus kesesinin hasar görmesi, somite eklenmesini, dönmesini ve ayrıca dolaşım sisteminin gelişimini bozarak başarılı bir sonucu engelleyebilir. Başlamak için, erkek sıçan serumunu 37 °C'de çözerek kültür ortamını hazırlayın. Ardından, sıçan serumunu 55 °C'de 30 dakika boyunca inaktive edin.Ardından 10,000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Oda sıcaklığında süpernatantı uzaklaştırın ve yüksek glukozlu, fenol kırmızı içermeyen DMEM ile bire bir oranda karıştırın. Besiyerini 0,45 mikronluk bir şırınga filtresi kullanarak sterilize edin.Embriyoları çıkarmak için uterusu izole edin ve salin içeren bir Petri kabına yerleştirin. Öncelikle, fazla kanı temizlemek için uterusu salin ile durulayın ve dış kısımdaki fazla yağ dokularını kesin. Görüntülemeyi iyileştirmek için uterusu, elleriniz sahne üzerinde sabitlenmiş haldeyken bir stereo mikroskop altında oda sıcaklığındaki tyro salin içeren temiz bir kaba aktarın.Rahmi soymak ve her bir embriyoyu ayırmak için küçük makaslar veya ince pensler kullanın. Uterin duvar ile decidua arasındaki boşluğa ince pensler yerleştirin ve vitellüs kesesinin yırtılmasını önlemek için minimum gerilim uygulayarak uterin duvarı geriye doğru soyun. Ardından, plasenta sizden uzak yöne bakacak şekilde decidua'yı yönlendirin.Ardından, forceps ile hat boyunca bir insizyon yaparak deciduanın koyu kısmını daha açık renkli kısmından ayırın. Çok derine kesmemeye dikkat edin. Plasentanın yolk sac'ın üst kısmından ayrılmasını tamamlayın.Ektoplasental konun veya EPC'nin yırtılmamasına dikkat edilmelidir. Bu noktada, vitellus kesesi üzerindeki Riker membranı görünür olmalıdır. Riker membranının vitellus kesesinden çıkarılması işlemin en zor kısmıdır; sabır ve sabit bir el gerektirir.Alttaki vitellüs kesesine zarar vermeden riker'ı hassas bir şekilde çıkarmak için, desiduanın tamamını çıkarmaya devam edin. Vitellüs kesesini delmemeye dikkat ederek, riker membranını EPC'den soyarak nazikçe sıkıştırın ve çıkarın. Eğer EPC zarar görürse veya vitellüs kesesinden ayrılırsa, embriyolar E 8.5 ile E 9.5 arasında normal şekilde dönmeyecektir.Riker membranı çıkarıldıktan sonra, embriyo yolk kesesi üzerinden kolayca görülebilmelidir. Otik vezikülün altından başlayıp kuyruk ucuna kadar bir taraf boyunca somitleri sayarak embriyoyu evreleyin. Yolk kesesine zarar vermeden embriyo üzerinde kullanmak için plastik bir transfer pipetinin ucunu kesin.Temiz roller şişelerini, embriyo başına bir mililitre besiyeri ile doldurun. Kullanılan roller şişesinin türüne bağlı olarak, her şişeye en fazla üç ila altı embriyo yüklenebilir. Besiyerini seyreltmemek için, mümkün olduğunca az tyros taşıyacak şekilde, kesik pipet kullanarak embriyoları besiyeriyle doldurulmuş roller şişesine aktarın.Kauçuk tıpaya cam roller şişesinin üst kısmına takın. Tıpa ile tambur arasında sıkı bir sızdırmazlık sağlanacak şekilde roller şişelerini roller kültür tamburuna yerleştirin. Tüm şişeler takıldıktan sonra, tamburdaki boş slotları kauçuk stoperlerle kapatın.Ardından silindiri aktifleştirin. Sonra, ön karışımlı CO2 O2 tankını açın ve çıkış valfinden saniyede bir kabarcık çıkacak şekilde yaklaşık iki PSI'ye ayarlayın. E 8.5 ve E 10 embriyoları için %20 O2 ve %5 CO2 kullanılmalıdır.İnkübatörün 37 °C'ye ayarlandığından emin olun ve embriyoları ışıktan korumak için inkübatörü kapatın veya üzerini örtün. Embriyo gelişimini değerlendirmek için somitlerin oluşumunu, dönme ilerlemesini ve nöral tüp kapanmasının derecesini periyodik olarak kontrol edin; kültürde iki ila üç saat geçtikten sonra, istenirse farmakolojik inhibitörler veya diğer tedaviler ekleyin. İnkübasyon tamamlandığında gazı kapatın, döner düzeneği durdurun ve şişeleri inkübatörden çıkarın.Embriyoları bir Petri kabı içindeki tyros veya PBS'ye geri aktarın. Stereo mikroskop altında, vitellus kesesi balon gibi görünmeli, kalp atışı gözlemlenmeli ve dolaşım belirgin olmalıdır. EPC yakınında bir delik açıp vitellus kesesini ve amniyonu embriyonun başı ve kalça kısmının üzerinden çevirerek vitellus kesesini embriyodan uzaklaştırın. Vitellus kesesini embriyodan ayırmak için göbek bağını kesin.Son olarak, embriyoyu sayıca yeterlilik ve açık kranial kıvrımlar, yüzün eksik kapanması ve/veya açık kaudal nöropor gibi nöral tüp defektleri açısından inceleyin. Embriyolar, çoklu morfogenetik değişimleri içeren Tyler sınıflandırmasına göre evrelendirilebilir. Embriyoların roller kültür öncesi ve sonrası görünümleri, burada diseksiyon anında gösterilmiştir. Embriyo, kuyruğun baş kıvrımlarının arkasında olduğu dönmemiş bir konfigürasyonda olmalıdır.Kültürde 24 saat geçtikten sonra, embriyolar dönme işlemini tamamlamış olmalı ve kuyruğun başın önünde olduğu, C şeklinde kıvrılmış bir fetal pozisyonda bulunmalıdır. Bu görüntü, üst sırada inhibitör eklenmemiş embriyoların gelişimini göstermektedir. Alt sıra ise, blastülasyon sırasında konvergent ekstansiyonun bilinen bir inhibitörü olan row A kinaz inhibitörü Y 2 76 32 ile yapılan farmakolojik manipülasyonun etkisini göstermektedir.Bu inhibitör, embriyoların kaudal aks boyunca kısalmasına neden olur ve kranial nöral kıvrım kapanmasını engeller. Verilerimiz, artan Y 2 7 6 3 2 dozlarının, kranial nöral kıvrım kapanmasını kademeli olarak bozduğunu ve vücut aksını kısalttığını göstermektedir; bu durum, kranial nöral ve konverjan ekstensiyondaki downstream row A sinyallemesinin rolü ile uyumludur. Dissection tekniği bir kez kavrandıktan sonra, altı ila 12 embriyodan oluşan bir batın için işlem 60 ila 90 dakikada tamamlanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, gelişimsel mekanizmaları sistem düzeyinde incelemek amacıyla, gebelik gün sekiz buçuk ile 10 arasındaki fare embriyolarını kültüre etmek için gereken adımlar hakkında kapsamlı bir bilgiye sahip olacaksınız.

neural-tube-closure-in-mouse-whole-embryo-culture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Tüm embriyo kültürü tekniği kültür fare ve sıçan embriyolar için bize izin...

Rotator-tipi Şişe Kültür Sistemi kullanılarak Kemirgen Tüm Embriyo Kültürü Yöntemi

Bu video protokolü, embriyonik gün 14-fare beyninde ganglion eminences nöral kök hücrelerin izolasyonu ve genişleme için neurosphere testinin uygulama göstermektedir.

Neurosphere Testi kullanarak Embriyonik Fare Nöral Kök Hücre Kültürü oluşturulması

Nöral tüpten embriyonik nöral krest izolasyonu kullanımını...

Embriyonik Mürin Nöral Tüp çıkan sinirsel Crest Hücre İzolasyonu ve Kültür

Kranial mezenşimi muhtemel nöral kıvrımların yükselmesi için bir itici güç sağlar dramatik morfojenik hareketleri...

Kranial mesenchyme Hücresel Davranış Değerlendirme için bir Eksplantasyon Assay

Ex vivo Fare neuroepithelium Tek Hücre Bölümler Canlı Görüntüleme

Embriyo kültürlerinde kullanılan serum, özellikle sinyalizasyon etkileşimler içeren çalışmalarda deney sonucunu etkileyebilecek bilinmeyen bileşenleri içerir. Burada bir serum içermeyen kültür sistemi kullanılan oksijenli ve 16-40 saat süre ile kültüre orta gebelik fare embriyo utero gelişen embriyo benzer morfolojik gelişimini gösteren göstermektedir.

Serumsuz Tüm Embriyo Kültür Sistemde Fare Embriyonik Development

Memeli tüm embriyo kültürü (WEC), teratoloji ve gelişim biyolojisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Hemen santrifüjlenmiş sıçan serumu, hem fare hem de sıçan WEC için bir ortam olarak yaygın olarak sağlanır. Bu videoda, memeli WEC'e uygun yüksek kaliteli sıçan serumunun hazırlanması için standart protokolümüzü gösteriyoruz.

Memeli Tüm Embriyo Kültürü için uygun Rat Serum hazırlanması

Burada, E13 fare embriyo ganglionic itibar bir roman mikrocerrahi teknik nöral kök hücrelerin izolasyonu için tanıtmak.

Yalıtım ve kültür embriyonik fare nöral kök hücrelerin

Bu protokol, öncelikle hücre göçü çalışmaları için fare modellerinden kranial nöral krest hücrelerinin diseksiyon ve kültürünü açıklar. Kullanılan canlı görüntüleme tekniklerini ve hız ve hücre şekli değişikliklerinin analizini anlatıyoruz.

Nöral Krest Hücre Delaminasyonu ve Göçü Çalışması İçin Fareden Birincil Kranial Nöral Krest Hücrelerinin Diseksiyonu, Kültürü ve Analizi

Bu protokol, civciv embriyo nörülasyonu sırasında nöral plak dokusunun mekanik özelliklerini uzunlamasına izlemek için geliştirilmiştir. Bir Brillouin mikroskobu ve bir sahne inkübasyon sisteminin entegrasyonuna dayanır ve ex ovo kültürlenmiş civciv embriyolarında nöral plaka dokusunun canlı mekanik görüntülemesini sağlar.

Civciv Embriyosunun Nöral Tüp Kapanması Sırasında Dokunun Mekanik Gelişiminin İzlenmesi

Öğrenin fare embriyolarında nöral tüp kapanışını izlemek için tam embriyo kültürü yöntemini. Bu teknik, gelişimsel biyoloji ve nöral tüp defektleri araştırmalarında farmakolojik müdahale olanakları sunar.

Nöral Tüp Kapatma Fare Tüm Embriyo Kültürü

Daha fazla video keşfet