Voltaj-kapılı potasyum Kanal mRNA gösterilmeden Tek hücreli RT-PCR teknikleri kullanarak Nigral Nöronlar

Bu prosedürün genel amacı, bireysel nöronlardaki haberci RNA'ları tespit etmektir. Bu, tek tek nöronların yama klemplenmesi ve kaydedilmesi, ardından Mr.mRNA ve sitoplazmadan kaydedilen her nörondan sitoplazmanın tamamen aspire edilmesiyle gerçekleştirilir. CD NA, PCR ile yapılır ve amplifiye edilir.

Sonuç olarak, reseptörler, iyon kanalları ve enzimler için spesifik mRNA'lar, geleneksel bir jel görüntüleme sistemi aracılığıyla tespit edilebilir. Benim adım, Tennessee Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi'nde çalışıyorum. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan bireyler mücadele edecektir çünkü tek bir nörodaki MRG miktarı son derece küçüktür ve kolayca kaybedilir.

Bu protokole, önemli nigranın orta rostral kısmını içeren 300 mikrometre kalınlığında koronal beyin dilimlerini kesmek için bir vibratör kullanarak başlayın. Beyinler 15 ila 40 günlük spra dolly sıçanlarından izole edilebilir. Dilim kesme işlemi, yüksek sakaroz kesme çözeltisinde buz gibi soğuk olarak gerçekleştirilir, %95 oksijen ve %5 karbondioksit ile oksijenlendirilir ve 7.4 pH'ta dilimler yapay beyin omurilik sıvısında inkübe edilir ve %5 karbondioksit, %95 oksijen gazı ile köpürtülür.

Sıcaklığı 34 santigrat derecede tutun ve dilimleri 45 dakika orada bırakın. Ardından beyin dilimlerini kaydedene kadar oda sıcaklığında tutun. Bir beyin dilimini bir yama kelepçesi kayıt odasına aktararak başlayın.

32 santigrat derecede oksijenli yapay beyin omurilik sıvısı ile sürekli perfüze edilir. Yama pipetlerini DNA ve RNA'lardan arındırılmış su ile hazırlanan otoklav hücre içi solüsyon ile doldurun. Yüklü bir pipeti banyoya indirin.

Direncin iki ila üç mega ohm arasında olduğunu kontrol edin. İlk olarak, önemli nigra'yı farklı ve anatomik konumuna göre bulun. Ardından, namar optiği ve 60 x objektif kullanarak, kayıt için SNC ve SNR'deki büyük hücreleri seçin.

Bunlar tereddüt etmeden olası dopaminerjik veya GABAerjik nöronlardır. Akım kelepçesi ve voltaj kelepçesi yapmak için geleneksel bir giga sıkı conta tüm hücre konfigürasyonu kullanın. Bu kayıtlar, mRNA bozulmasını en aza indirmek için genellikle beş dakikadan daha kısa sürede gerçekleştirilmelidir.

Yaklaşık bir dakika içinde, ilgilenilen nöronlar için sadece zarlarını ve sivri uçlarını kaydederek elektrofizyolojik parmak izleri sağlamak mümkündür. İlgilenilen bir nörondan veri elde ettikten sonra, sitoplazmayı aspire etmek için nazik ağız emme kullanın. Sıkı conta aksi takdirde kırılmamalıdır.

mRNA da dahil olmak üzere hücre dışı kalıntılar, yama pipetine emilebilir ve hücre içeriğini kirletebilir. Pipet ucunu kırarak ve hafif pozitif basınç uygulayarak hücre içeriğini 0,2 mililitrelik bir PCR tüpüne atın. Bittiğinde, mRNA'lar içerebilecek hücre dışı kalıntıların kontaminasyonunu önlemek için tüpü hemen negatif 20 dondurucuya yerleştirin.

Herhangi bir aspirasyon kullanmadan doku içine indirilen bir yama pipetinin içeriğini toplayarak negatif bir kontrol yapın. 10 ila 20 nöron arasında hücre içeriği topladıktan sonra hemen ters transkripsiyon reaksiyonuna başlar. mRNA'ların bozulmasını en aza indirmek için, herhangi bir kirletici genomik DNA'yı DNA'larla, biri beş dakika, A 25 santigrat derece sindirerek başlayın.

Bu adım, olası yanlış pozitifleri azaltmada kritik öneme sahiptir ve atlatılmamalıdır. Daha sonra DNA'ları 1.2 mikrolitre 25 milimolar EDTA ile etkisiz hale getirin ve örnekleri beş dakika boyunca 70 santigrat derecede inkübe edin. Şimdi, genomik DNA'nın tamamen çıkarıldığını doğrulamak için CD NA'yı sentezlemek için ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanın.

Ters transkriptaz olmadan her numunenin bir kontrol reaksiyonunu çalıştırın. Diğer tüm reaksiyon bileşenleri aynı kalırken. Ürünleri eksi 20 santigrat derecede PCR tasarımı için ihtiyaç duyulana kadar saklayın.

Gen bankasındaki dizilere göre primerler, mümkün olduğunda, genomik DNA kontaminasyonunu tespit etmeye yardımcı olmak için asal onarımları kapsayan T girişi yapar. Primer çiftlerinin etkinliğini kontrol etmek için, ilk aşamada tüm beyin CD NA üzerinde test edin. PCR, standart bir termal döngü protokolü kullanarak 30 mikrolitre CDNA'nın beş mikrolitresini 35 döngü için çoğaltır.

İkinci aşama için, PCR, aynı ana onarımla birinci aşama PCR ürününün bir mikrolitresini çoğaltır ve biraz değiştirilmiş bir döngü profili kullanır. Şimdi ürünleri %2,5'lik bir AGROS jel üzerinde ayırın ve AUM bromür veya jel yeşili kullanarak görselleştirin. UV ışığı altında, pozitif DNA bantlarını kesin ve DNA'yı toplamak için ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanarak bunları sıralayın.

Önemli nigra, pars, compacta ve pars reticulata'daki nöronların elektrofizyolojik özellikleri karşılaştırıldı. SNR GABAerjik nöronlar, yaklaşık 10 hertz'de spontan yükselme ile daha yüksek frekans sergiledi. Sivri uçlar, hiperpolarize akım enjeksiyonu üzerine yaklaşık bir milisaniye civarında bir temel süreye sahipti.

SNR GABAerjik nöronlar, haftalık olarak aktive edilmiş bir akımı gösteren ince bir SAG tepkisi gösterdi. Buna karşılık, zenci dopaminerjik nöronlar, yaklaşık üç milisaniyelik bir taban süresi ile düşük frekanslı spontan sivri uçlar sergiledi. Dopaminerjik nöronlar ayrıca hiperpolarizasyona yanıt olarak belirgin bir SAG gösterdi, bu da SNR GABAerjik nöronlarda güçlü bir IH akımı ekspresyonunu gösterdi, ancak dopaminerjik nöronlarda değil.

Tek hücreli R-T-P-C-R, GABA sentezinde anahtar bir enzim olan glutamik asit dekarboksilaz için mRNA tespit etti. Buna karşılık, tanımlanmış bir SNC ve SNR dopaminerjik nöronları, ancak GABAerjik nöronlarda değil. Tek hücreli R-T-P-C-R, dopamin sentezi için anahtar bir enzim olan tirozin hidroksilaz için mRNA'yı tespit etti.

Daha sonra, gerilim kapılı potasyum kanallarının özelliklerini değiştiren voltajla aktive edilmiş KV üç kanallı alt birimlerin ifadesini profillemek için tek hücreli R-T-P-C-R kullanıldı. Örnek SNR gaba'da, KV 3.1, 3.2, 3.3 ve 3.4 için nöron mRNA'ları yalnızca örnek bir S-N-R-D-A nöronunda tespit edildi. Toplanan verilerde KV 3.2, 3.3 ve 3.4 tespit edildi.

KV 3.1, SNR GABAerjik nöronlarda nigro dopaminerjik nöronlara göre daha sık tespit edildi, bu da hızlı Viking SNR GABA nöronlarında daha yüksek bir KV 3.1 ekspresyon seviyesini gösterdi. Bu prosedürü denerken, eldiven giymeyi unutmamak ve geliştirildikten sonra alet bilimini serbest bırakmak önemlidir. Bu teknik, sinirbilim alanındaki araştırmacıların sinir sistemindeki reseptörlerin ve iyon kanallarının ifadesini ve işlevini keşfetmelerinin yolunu açtı.