Glial Hücrelerin Tek Hücreli Görüntülenmesi için Drosophila Beyinlerinin İmmünofloresan Boyaması

Hücreye özgü bir rekombinaz sistemi barındıran farklı glial hücre tipleri içeren transgenik Drosophila sineklerinden elde edilen beyinlerle başlayın.

Aynı tip hücreler üzerinde farklı antijenik epitoplara kaynaşmış bir hücre yüzeyi proteininin ekspresyonunu yönlendirir.

Proteinleri çapraz bağlamak ve doku mimarisini korumak için dokuyu bir fiksatif ile tedavi edin.

Fazla fiksatifi çıkarmak için yıkayın.

Arka plan lekelenmesini azaltmak için spesifik olmayan bağlanma bölgelerini maskelemek için bloke edici proteinler ekleyin.

Dokuyu, glial hücreler üzerinde eksprese edilen farklı epitoplara bağlanan bir birincil antikor kokteyli ile inkübe edin.

Bağlanmamış primer antikorları çıkarmak için yıkayın.

Primer antikorlara bağlanan florofor konjuge sekonje sekonder antikorlarla inkübe edin.

Bağlanmamış ikincil antikorları çıkarmak için yıkayın.

Beyni bir görüntüleme ara parçasının içine monte edin ve bir lamel yerleştirin. Ara parça, üç boyutlu yapısını koruyarak doku için bir oda oluşturur.

Farklı florofor-konjuge antikorlarla etiketlenmiş aynı glial tipteki farklı hücreler, hücre-hücre etkileşimlerinin anlaşılmasını sağlar.

İzole edilmiş beyinleri bir P10 pipet ucu kullanarak fiksatif solüsyon içeren 200 mikrolitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Beyinleri asla forseps kullanarak tutmayın. Işıktan korunan dokuları inkübe edin. Çözelti transferleri sırasında beyinleri aspire etmekten kaçının.

Sabitleyiciyi çıkarmak için, yıkama solüsyonu ile üç veya daha fazla 15 dakikalık yıkama kullanın. Ardından, dokuları 30 dakika veya daha uzun süre bloke edici solüsyonla bloke edin. Daha sonra, bloke etme solüsyonunu yıkama solüsyonunda seyreltilmiş primer antikorlarla değiştirin ve beyinleri gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin.

Birincil antikorları çıkarmak için, yıkama solüsyonunda 1 saatlik üç yıkama kullanın. Daha sonra, yıkama çözeltisine ikincil florofor konjuge antikorları ekleyin ve beyinleri gece boyunca 4 santigrat derecede veya oda sıcaklığında 4 saat boyunca inkübe edin. Bağlanmamış antikorları tamamen yıkamak için, yıkama solüsyonunda 1 saatlik üç yıkama kullanın, ardından PBS ile daha uzun bir yıkama yapın.

Sonra, beyinleri monte edin. Bir görüntüleme ara parçası ile iki lamel hazırlayın. Ara parçaya ve ekstra lamel üzerine, solmaya karşı önleyici bir madde ile 10 mikrolitre montaj ortamı uygulayın. Daha sonra, bir P10 pipeti kullanarak, beyinleri lamel üzerine aktarın ve bunları bir miktar PBS ile birlikte ortamın yanına bırakın. Dokunun kurumasına izin vermeyin.

Şimdi, pipeti kullanarak beyinleri dikkatlice montaj ortamına taşıyın. Ve son olarak, onları ara parçadaki ortama taşıyın ve forseps ile düzenleyin. Ardından, ara parçalardaki yapışkan astarı çıkarın ve bir lamel takın. Lameli forseps kullanarak biraz basınçla sabitleyin ve hemen görüntülemeye devam edin.