Name: Akustik Microstreaming kullanarak Standart Laboratuvar Reverse Transcriptase reaksiyonlarda mRNA Tek hücreli Miktarları cDNA Verim artırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 52 s
Description: Öğrenin, akustik mikroakışkanlık kullanan mikromikser ile tek hücreli mRNA'dan cDNA verimini nasıl artırabilirsiniz. Bu yöntem, standart ters transkripsiyon reaksiyonlarında gen ekspresyonu analizlerini iyileştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Sağlık ve Tıp Araştırma Konseyi Avustralya (proje hibe hayır °. 6.288.480) ve Scobie ve Clare MacKinnon Güven tarafından desteklenmiştir.

1. RT Reaksiyon Micromixing <ol><li> Micromixing RT tepki gerçekleştirmeden önce, RT tepki istenilen sıcaklığa micromixer dengelenmesi. <ol><li> Micromixer 37 içine yerleştirin ° C (veya RT tedarikçi tarafından tavsiye edilen sıcaklık) inkübatör RT reaksiyonun başlangıcı için en az 1 saat önce için. </li></ol></li><li> RT karışımı ters transkriptaz tedarikçisi göre ayarlayın (örneğin Promega, Qiagen gelen Omniscript MMTV-RT) talimatları yerine ng-mg giriş toplam RNA (örneğin 0.1-1pg/μl), tek hücreli miktarda hariç tedarikçiler tarafından tavsiye edilen miktarda. <ol><li> Biz standart steril, nükleaz 200μL ince duvarlı PCR tüpleri kullanırlar. </li></ol></li><li> Karıştırma için hazır olan en kısa sürede güvenli bir şekilde micromixer içine pozisyon RT tüpler. Micromixer RT reaksiyon süresi 37 ° C inkübatör içinde kalmalıdır. </li><li> Uygun frekans ve micromixing genlik seçin. Bu örnekte, 150Hz kullanın. </li><li> Micromixer açın ve RT tepki (60 dakika) süresi boyunca bekletin. </li><li> Micromixer kapatın ve RT reaksiyon tamamlandıktan sonra RT tüpleri almak. </li><li> RT tüpleri, buz üzerinde yerleştirin ve kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qPCR veya gerçek-zamanlı PCR) gibi daha fazla uygulamaları ile normal olarak devam edin. </li></ol> 2. Temsilcisi Sonuçlar: RT reaksiyonlar bağlamında micromixing yararı cDNA verimi diğer karıştırma yöntemleri (örneğin, sallayarak karıştırın veya öğütme) kullanıldığında göreceli bir artış. Bu cDNA kullanarak kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qPCR veya gerçek-zamanlı PCR) sonraki analizi üzerine, örneğin, görülebilmektedir. Şekil 2A hemen önce RT inkübasyon (siyah, "öğütme" RT reaksiyon öğütme ile karşılaştırıldığında, ilk 5 dakika için micromixing etkileri (mavi, "micromixed5") ya da tüm 60 dakika (kırmızı, "micromixed60") göstermektedir .) Bu durumda önceki RT reaksiyon hacmi 25μL ve total RNA 2.5pg içeriyordu. cDNA temsil Nurr-1 mRNA algılamak için tasarlanmış primerler kullanılarak qPCR izleri yukarıda gösterildiği anlamına gelir ± 3 Bu aynı deneyi tekrarlar% 50 maksimum floresans ulaşmak için döngüleri sayısı SEM'ler aşağıda çizilir. Yıldız işareti (Tukey çoklu karşılaştırmalar tek yönlü ANOVA) istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık göstermektedir. Önceki RT reaksiyon tüm 60 dakika boyunca micromixing öğütme üzerinde önemli bir gelişme ise önceki RT reaksiyon ilk 5 dakika micromixing öğütme üzerinde anlamlı olmayan iyileşme üretilen, büyüklüğü yaklaşık 15 qPCR eşdeğer döngüleri, ortalama. Micromixing yararı da elde edilen sonraki qPCR ürünlerin erime eğrisi analizinin görülebilir. Sadece tutarsız qPCR üretilen ilk 5 dakika veya öğütme için micromixing ise, önceki RT reaksiyon tüm 60 dakika boyunca micromixing Şekil 2B gösterilen deney, tutarlı bir yinelenen örnekleri qPCR sinyal (Şekil 2BA, 2 kırmızı izleri) sonuçlandı izleri (Şekil 2BA, 2 mavi izleri ve 2 siyah izleri, sırasıyla). Gri izleri qPCR reaksiyon kaldı cDNA hangi negatif kontroller ("negatif"). Bu deneyde qPCR ürünleri belliydi sıcaklığı (yani erime eğrisi analizi) Ramping denatüre olduğunu ne zaman uygun PCR ürünleri (yani, mRNA çok daha yüksek konsantrasyonlarda ters qPCR transkripsiyonu ve amplifiye edildi, elde edilen aynıydı bir Amplikon gösterilmemiştir) 60 dakika (Şekil 2BB, 2 kırmızı izleri) micromixed olmuştu sadece RT reaksiyonlar sunuldu. Tüm diğerleri (yani micromixed5, öğütme ve negatif kontroller), alternatif Amplikon ürünler (örneğin, astar dimerleri) oluşturulur. <img src="/files/ftp_upload/3144/3144fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 standart laboratuvar RT reaksiyonlara micromixing uygulamak için protokol Akış diyagramı. Referanslar 13,14 fiziksel prensibi yer micromixer ve nasıl bir in-house micromixer inşa etmek için daha ayrıntılı açıklamalar verilmiştir <img src="/files/ftp_upload/3144/3144fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 RT aksi standart laboratuvar RT reaksiyonlarda mRNA tek hücreli miktarlarda oluşan reaksiyonlar önceki uygulanan micromixing faydaları gösteren Temsilcisi qPCR veri Nurr-1 genini kodlayan cDNA temsil eden mRNA tespit qPCR izleri Bir ​​Örnek. Önceki RT reaksiyonlar 25μL hacmi toplam RNA 2.5pg yer alan ve 37 ° C'de 60 dakika için bir kuluçka yapıldı. RT reaksiyonlar R öğütme tarafından karıştırıldıT RT reaksiyon (mavi izleri "micromixed5") ilk 5 dakika boyunca (kırmızı izleri "micromixed60" micromixed veya RT reaksiyon tüm 60 dakika boyunca micromixed inkübasyon (siyah izleri "öğütme") önce karışmaktadır .) Ortalamalar ±% 50 maksimum floresans ulaşmak için gerekli qPCR döngülerinin sayısı SEM'ler aşağıda çizilir n = 3 bu deneyi tekrarlar. Asterisk (Tukey çoklu karşılaştırmalar tek yönlü ANOVA) anlamlı bir farklılık gösterir. B bir başka qPCR deney 25μL hacmi toplam RNA içeren 25pg RT reaksiyonlar aşağıdaki Nurr-1 cDNA ürünü inceleyerek, bu sefer. qPCR izlerinin yanı sıra elde edilen qPCR ürün eğrisi analizi (a) erime (b) farklı karıştırma koşullar için gösterilmiştir. Hiçbir cDNA önceki RT tepki olarak dahil edildiği negatif kontrolleri de (gri izleri, "negatif") yer almaktadır. MRNA çok daha yüksek konsantrasyonlarda RT reaksiyonlar da yapılan ve (b), micromixed60 için (kırmızı izlerini) örnekleri aynı erime eğrisi zirveleri (veriler gösterilmemiştir) üretildi .

<ol><li>Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+Funct+Genomic+Proteomic%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Brief Funct Genomic Proteomic.</a> 2 (1), 31-31 (2003).</li>
<li>Aumann, T. D., Gantois, I., Egan, K. Exp Neurol. 213 (2), 419-419 (2008).</li>
<li>Ottino, J. M., Wiggins, S. Philos Transact A Math Phys Eng Sci. 362 (1818), 923-923 (2004).</li>
<li>Losey, M. W., Jackman, R. J., Firebaugh, S. L. J Microelectromech. Syst. 11, 709-709 (2002).</li>
<li>Bontoux, N., Dauphinot, L., Vitalis, T. Lab Chip. 8 (3), 443-443 (2008).</li>
<li>Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Anal Chem. 78 (9), 3084-3084 (2006).</li>
<li>Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Anal Chem. 78 (3), 956-956 (2006).</li>
<li>Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (47), 17807-17807 (2006).</li>
<li>Jiao, Z. J., Huang, X. Y. Microfluidics Nanofluidics. 6, 847-847 (2009).</li>
<li>Ahmed, D., Xiaole, M., Juluri, B. K. Microfluidics Nanofluidics. 7, 727-727 (2009).</li>
<li>Paxton, W. F., O'Hara, M. J., Peper, S. M. Anal Chem. 80, 4070-4070 (2008).</li>
<li>Autom, L. ab 11, 399-399 (2006).</li>
<li>Petkovic-Duran, K., Manasseh, R., Zhu, Y. 47 (4), 827-827 (2009).</li>
<li>Boon, W. C., Petkovic-Duran, K., White, K. 50 (2), 116-116 (2011).</li>
<li>Liu, R. H., Lenigk, R., Druyor-Sanchez, R. L. Anal Chem. 75 (8), 1911-1911 (1911).</li>
<li>Riley, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ann+Rev+Fluid+Mech%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Ann Rev Fluid Mech.</a> 33, 43-43 (2001).</li>
<li>Whitehill, J., Neild, A., Ng, T. W. Applied Physics Letters. 96 (5), 053501-053501 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa etmek için bir şey var.

Standart laboratuvar RT reaksiyonlara micromixing uygulama yöntemi, tabii ki, tutabilen burada açıklanan herhangi bir yöntemle (örneğin, hücre parçalama, lazer yakalama mikrodiseksiyon) ile hasat mRNA. Aynı zamanda herhangi bir marka veya türleri RT reaktifleri, herhangi bir sıcaklık (micromixer malzemelerin tolerans içinde), ve herhangi bir süre oluşur. Örneğin, RT rastgele hexamer veya oligo-dT primerleri oluşan reaksiyonlar gelişmiş cDNA verim gözlemledik. Aşağıdaki kısıtlamalara uygun diğer biyokimyasal dönüşümler (...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Total RNA ek bileşenini dondurulmuş akut hazırlanan yetişkin farenin orta beyin dilimleri izole edildi </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PicoPure RNA İzolasyon Kiti </td><td> Arcturus, CA, USA </td><td> KIT0204 </td><td> Kiti artık Applied Biosystems edinilebilir. </td></tr><tr><td> DNA ücretsiz DNaz Arıtma ve Kaldırma Reaktifler </td><td> Ambion </td><td> AM1906M </td><td></td></tr><tr><td> Rastgele hexamer primerleri </td><td> Promega </td><td> C1181 </td><td></td></tr><tr><td> AMV-RT </td><td> Promega </td><td> M5101 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP seti </td><td> Promega </td><td> U1240 </td><td></td></tr><tr><td> RNasin Ribonükleaz İnhibitörü </td><td> Promega </td><td> N2111 </td><td></td></tr><tr><td> Nükleazlar-Ücretsiz Su </td><td> Promega </td><td> P1193 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Yeşil PCR Master Mix </td><td> Uygulamalı Biosystem </td><td> 4309155 </td><td></td></tr><tr><td> Hprt ileri (20mer): CTT TGC TGA SKK GCT GGA TT </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hprt ters (20mer): TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nurr1 ileri (23mer): CAG CTC CGA TTT CTT AAC TTK AG </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nurr1 ters (23mer): GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1000 NanoDrop Spektrofotometre. </td><td> Thermo Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Corbett Rotor Gen RG-6000 </td><td> Corbett Yaşam Bilimleri </td><td></td><td> Corbett Yaşam Bilimleri QIAGEN tarafından Temmuz 2008&#39;de satın alındı </td></tr></tbody></table>

akustik microstreaming kullanarak standart laboratuvar reverse transcriptase reaksiyonlarda mrna tek hücreli miktarları cdna verim artırılması

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

Gen ekspresyonu hücre davranışı ile ilişkilendirerek ideal tek hücre düzeyinde yapılır. Ancak, tek bir hücrenin (1-5, 1-50pg toplam RNA ya da% 0.01-2.5pg mRNA, hücre başına 1) mevcut labil mRNA transkripsiyonu tersine çevirmek için önce küçük bir miktar daha çok düşürür, çünkü bu kolayca elde değil . istikrarlı bir cDNA kopyası haline. Örneğin, standart laboratuar reaktifleri ve donanım kullanarak, genlerin sadece az sayıda hücre başına 2 nitel değerlendirilir olabilir. MRNA tek hücreli miktarda oluşan standart laboratuvar ters transkriptaz (RT) reaksiyonlar (mikrolitrelik hacimleri yani standart reaktifler) verimliliği artırmak için bir şekilde düşürür önce mRNA cDNA dönüştürülebilir, böylece daha hızlı reaktifler karıştırmak olacaktır. Ancak mikrolitrelik ölçekler sıvı akışı laminer olduğunu, çünkü bu önemsiz değildir, yani mevcut karıştırma yöntemleri (sallayarak, vorteks ve öğütme yani), etkin bir şekilde reaktifleri karıştırmak için yeterli kaotik hareket üretemez. Bu sorunu çözmek için, mikro ölçekli karıştırma teknikleri 3,4 kullanılır. Mikroakışkan tabanlı karıştırma teknolojileri başarıyla RT reaksiyon verimi 5-8 artış geliştirilmiştir. Ancak, Mikroakiskan teknolojileri, nispeten pahalı ve henüz yaygın değil özel bir donanım gerektirir. Daha ucuz, daha rahat bir çözüm arzu edilir. Bu çalışmanın ana amacı, mRNA tek hücreli miktarlarda oluşan standart laboratuvar RT reaksiyonlar bir romanı &quot;micromixing&quot; tekniği uygulaması cDNA verimi önemli ölçüde artırır nasıl göstermektir. Biz cDNA verim sağlar yaklaşık 10-100-katlama, artış bulabilirsiniz: (1) daha fazla sayıda hücre başına analiz edilmesi gereken genler, gen ekspresyonu (2) daha düşük bolluk genlerin kantitatif analiz ve (3) daha iyi algılama tek hücre. Micromixing akustik, 9-12 küçük bir engel etrafında yayılan ses dalgalarını engel yakın bir ortalama akışı oluşturmak bir fenomen microstreaming dayanmaktadır. Biz kilit bir sadeleştirme ile akustik bir microstreaming tabanlı cihaz (&quot;micromixer&quot;); akustik microstreaming sistemi, küçük bir eğrilik 13 yarıçapı ile bir sıvı-hava arayüzü sağlayarak ses frekansları elde edilebilir . Bir tüp bir çözüm mikrolitrelik hacmi menisküs uygun küçük bir eğrilik yarıçapı sağlar. Ses frekanslarının kullanımı, donanım ucuz ve 13 çok yönlü olması anlamına gelir ve standart laboratuvar sonicators olabileceği gibi, nükleik asitler ve diğer biyokimyasal reaktifler zarar görmezler.

Biz aksi takdirde standart laboratuvar ters transkripsiyon reaksiyonları mRNA tek hücreli miktarda cDNA verimi artırmak için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Yenilik, titreme, vorteks veya öğütme daha etkili mikrolitrelik ölçekler sıvıları karıştırmak için, akustik microstreaming fenomeni kullanan bir micromixer, kullanımı bulunur.

Akustik Microstreaming kullanarak Standart Laboratuvar Reverse Transcriptase reaksiyonlarda mRNA Tek hücreli Miktarları cDNA Verim artırılması

Gen ekspresyonu ile hücre davranışının ilişkilendirilmesi, ideal olarak tek hücre düzeyinde gerçekleştirilir. Ancak, ... miktarındaki azlık nedeniyle bu durum kolayca başarılamamaktadır.

Bu prosedür, tek hücre miktarlarındaki mRNA'dan CD NA verimini artırır. İşleme, mikro karıştırıcıyı istenen ters transkripsiyon reaksiyon sıcaklığına ayarlanmış bir inkübatör içinde dengeleyerek başlayın. Ardından, mikrolitre hacimlerde tek hücre RNA miktarlarını içeren standart laboratuvar RT reaksiyonlarını hazırlayın.Reaksiyon tüpünü karıştırma deliklerine güvenli bir şekilde yerleştirin, uygun karıştırma parametrelerini seçin ve mikro karıştırıcıyı açın. Nihayetinde bu prosedür, RT reaksiyonu için hazırlık olarak kantitatif PCR aracılığıyla artırılmış CDNA verimleri elde etmek için kullanılabilir. Mikro karıştırıcıyı en az bir saat boyunca 37 °C bir inkübatörde dengeleyin.Standart steril, nükleaz içermeyen 200 µL ince duvarlı PCR tüplerinde. Ters transkriptaz reaksiyonlarını, girdi toplam RNA miktarı olarak tek hücre miktarları kullanmak dışında, tedarikçinin talimatlarına göre hazırlayın. Şimdi uygun mikro karıştırma frekansını ve genliğini seçin.Ardından tüpü mikro karıştırıcıya güvenli bir şekilde yerleştirin. Sonra mikro karıştırıcıyı açın. Reaksiyonun 60 dakika boyunca devam etmesini sağlayın; işlem tamamlandığında mikro karıştırıcıyı kapatın ve reaksiyonları, sonraki aşağı akış uygulamalarında hemen kullanmak üzere buza aktarın. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, RT reaksiyonları bağlamında mikro karıştırmanın temel avantajı cDNA verimidir.Bu kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu analizinde, neuro one mRNA'sını temsil eden cDNA'yı tespit etmek için tasarlanmış primerler kullanılarak elde edilen QPCR izleri, ilk beş dakika veya toplam 60 dakika boyunca gerçekleştirilen microm karıştırmanın etkilerini, RT inkübasyonu hemen öncesindeki RT reaksiyon süresiyle karşılaştırmalı olarak göstermektedir. İlk beş dakika boyunca yapılan microm karıştırma, işleminle karşılaştırıldığında anlamlı bir iyileşme sağlamamıştır. Ancak, tüm 60 dakika boyunca yapılan microm karıştırma, 15 QPCR döngüsüne eşdeğer anlamlı bir verim artışı sağlamıştır.Ayrıca, QPCR'ın erime eğrisi analizi, önceki R iki reaksiyonunun tüm 60 dakikası boyunca mikro karıştırmanın, kırmızı izlerle gösterildiği gibi duble örneklerde tutarlı bir sinyal oluşturduğunu kanıtlamaktadır. Bu durum, maviyle gösterilen ilk beş dakika boyunca mikro karıştırma yapılan veya siyahla gösterilen yalnızca inkübasyon yapılan durumlarda gözlemlenen değişken izlerin aksinedir; gri izler ise kalıp kontroleridir.

increasing-cdna-yields-from-single-cell-quantities-mrna-standard

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz postmortem insan beyni superior temporal girus III. Tabakası homojen bir hücre popülasyonu, piramidal nöronlar, RNA izole etmek ve ayıklamak için lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanarak bir süreci tanımlar. Biz (T7 tabanlı) mRNA daha sonra doğrusal yükseltmek. Kullanmakta olduğunuz örnek Affymetrix insan X3P mikroarray melezleşme.

İnsan Postmortem Beyin Dokusu Tek Hücre Popülasyonlar Yüksek Kalite RNA Alınması

Burada örnek sınırlı miktarda çalışma, özellikle microRNA (miRNA) ekspresyon düzeyleri için bir maliyet ve zaman etkili yüksek verimli bir tarama aracı olarak mikroakışkan platformu ile birlikte optimize edilmiş bir multiplex ters transkriptaz kantitatif PCR (QRT PCR) protokolü açıklamak.

Yüksek Verimli MicroRNA Profil: Optimize edilmiş, Multiplex QRT-PCR Fluidigm Dinamik ArrayTM IFCS Nanoliter Ölçeğinde

Bu yazıda, sıçan primer nöronal kültürlerin ve sonraki transcriptome analizi Arna amplifikasyon kullanarak tek hücre hasat için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, herhangi bir hücre tipi için genellenememektedir.

Tek Hücre Transcriptome Analizi

HIV-1 RNA düzeyi, plazma ve sıralama miktarının tek HIV-1 viral yük saptama sınırının altında (50-75 kopya / ml) bireylerin genomların zordur. Burada özü ve güvenilir bir şekilde HIV-1 RNA 0.3 kopya / ml tedbirler ve çok düşük viral yük örnekleri, tek bir genom sıralama viral genomların yükseltmek için nasıl bir gerçek zamanlı PCR kullanarak plazma viral RNA miktarını nasıl açıklar.

Standart Klinik Tahliller Algılama Sınırı Aşağıda Viral Yükler HIV enfekte kişilerde kuvvetlendirme ve HIV-1 RNA miktarının

Biz beyin omurilik sıvısı (BOS) microRNA profili gerçek zamanlı PCR bir protokol açıklar. RNA ekstre etme protokolleri hariç, prosedür diğer vücut sıvıları, kültürlenmiş hücreler ya da doku örneklerinden elde edilen RNA ile uzatılabilir.

Kantitatif Real Time PCR kullanarak Beyin Omurilik Sıvısı MicroRNA Profil

Tek memeli hücrelerini sıralamak ve her hücrede ilgilenilen 96'ya kadar hedef genin ekspresyonunu ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, mutlak transkript sayılarının tahminini sağlamak için dahili qPCR standartlarının kullanılmasını içerir.

İç Standartları FACS ve qPCR kullanma Tek hücreli Gen İfadesi Profil

Bu iletişim kuralı kritik adımlar ve yama-kelepçe sonra tek hücre multiplex Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirmek için gereken önlemleri açıklar. Bu teknik ifade profil genler tarafından yama-kelepçe kayıtları ile karakterize bir tek hücreden önceden belirlenmiş bir dizi analiz etmek için basit ve etkili bir yöntemdir.

Tek hücre Multiplex Ters transkripsiyon polimeraz zincir tepkimesi sonra yama-kelepçe

Memeli hücre HeLa hücreleri kullanarak döngüsü sırasında eğitim RNA-interactors için çift iplikçikli RNA bağlayıcı protein kinaz (PKR) RNA-harekete geçirmek ve deneysel yaklaşımlar mevcut. Formaldehit crosslink RNA-PKR kompleksleri ve immunoprecipitation PKR bağımlı RNA'ların zenginleştirmek için bu yöntemi kullanır. Bu RNA'ların daha da yüksek üretilen iş sıralama veya qRT-PCR ile çözümlenebilir.

RNA Interactors Protein kinaz memeli hücre döngüsü sırasında RNA-harekete geçirmek, eğitim

cDNA'nın kinetik çapraz bağlanması ve analizi, canlı hücrelerdeki protein-RNA etkileşimlerinin dinamiklerinin yüksek zamansal çözünürlükte araştırılmasını sağlayan bir yöntemdir. Burada protokol, maya hücrelerinin büyümesi, UV çapraz bağlama, hasat, protein saflaştırma ve yeni nesil dizileme kütüphanesi hazırlama adımları dahil olmak üzere ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

χCRAC Kullanarak Yüksek Zamansal Çözünürlükte Protein-RNA Etkileşim Dinamiğinin İn Vivo İzlenmesi

Bu makalede, tek veya toplu C. elegans örneklerinde gen ekspresyon seviyelerinin hızlı ve güvenilir bir şekilde belirlenmesi için yüksek aktarım hızı protokolü açıklanmıştır. Bu protokol RNA yalıtımı gerektirmez ve doğrudan örneklerden cDNA üretir. Yüksek verimli çok katlı nanoakışkan gerçek zamanlı qPCR platformları ile birlikte kullanılabilir.

Nanoakışkan Teknoloji Kullanarak Tek ve Toplu C. elegans Örneklerinde Yüksek Verimli Nicel RT-PCR

Öğrenin, akustik mikroakışkanlık kullanan mikromikser ile tek hücreli mRNA'dan cDNA verimini nasıl artırabilirsiniz. Bu yöntem, standart ters transkripsiyon reaksiyonlarında gen ekspresyonu analizlerini iyileştirir.

Akustik Microstreaming kullanarak Standart Laboratuvar Reverse Transcriptase reaksiyonlarda mRNA Tek hücreli Miktarları cDNA Verim artırılması (Video) | JoVE Journal

Akustik Microstreaming kullanarak Standart Laboratuvar Reverse Transcriptase reaksiyonlarda mRNA Tek hücreli Miktarları cDNA Verim artırılması

Daha fazla video keşfet