Tek iplikli DNA, çift iplikli DNA ve RNA Hidroksiapatit Kromatografisi kullanarak bir Çevre Viral Topluluk ayrılması

Bu video, karışık viral toplulukları nükleik asit bileşimlerine göre ayırmak için bir prosedürü göstermektedir. Bu, karmaşık viral toplulukların taksonomik çeşitliliğinin ve fonksiyonel potansiyelinin incelenmesini sağlar. Burada, nükleik asitlerin ayrılmasında kristal bir kalsiyum fosfat formu olan hidroksiapatit kullanılır.

İlk olarak, bir Hidroksiapatit sütunu paketlenir ve dengelenmiş saflaştırılmış viral nükleik asitler daha sonra sütuna uygulanır, hidroksiapatitin pozitif yüklü kalsiyum iyonları ile nükleik asit alt tiplerinin negatif yüklü fosfat omurgası arasındaki yük etkileşimi, nükleik asitleri sütun Nick'e bağlar. Sonraki tek sarmallı, D-N-A-R-N-A ve çift sarmallı DNA, farklı konsantrasyonlarda fosfat tamponu ile sırayla ima edilir. Elde edilen nükleik asitler daha sonra tuzdan arındırılır ve DNA dizilimi ile görselleştirme, miktar tayini ve tanımlaması için hazırlık amacıyla konsantre edilir Agros jel elektroforezi, nükleik asit türlerinin %9'dan daha az taşıma ile ayrılabileceğini doğrular.

Böylece bu yöntem, viral toplulukların çeşitliliğinin ve işlevsel kapasitesinin değerlendirilmesini sağlar. Merhaba, benim adım Doug Fro ve j Craig Girişim Enstitüsü'nde Dr.Shannon Williamson'ın laboratuvarında araştırma görevlisiyim. Bugün size tek sarmallı DNA'yı, çift sarmallı DNA'yı ve RNA'yı çevresel bir viral topluluktan ayırmak için bir prosedür göstereceğim.

Bu yöntemin, DNA veya RNA'yı hedef alan çekirdekle tedavi gibi mevcut yöntemlere göre avantajları vardır. Hidroksiapatit kromatografisi, tüm viral topluluğu yakalama yeteneğine sahiptir. Bu yöntem, viral ekoloji alanındaki birkaç soruyu cevaplamamızı sağlar.

Örneğin, toplam gen tamamlayıcısı veya viral topluluğun çeşitliliği nedir? Bu yöntemi ilk olarak, Chesapeake Körfezi'ndeki tüm Rio Plankton topluluklarını, genetik imzanın bir alt kümesini feda etmeden incelemek istediğimizde düşündük. Bu deney için gerekli çözeltiler, ekteki yazılı protokoldeki talimatlara göre önceden hazırlanmalı ve 0.12 molar fosfat tamponu, 0.20 molar fosfat tamponu, 0.40 molar fosfat tamponu ve bir molar fosfat çözeltisi içermelidir.

Deney gününde hepsi pH 6.8'de ve hidratlı hidroksiapatitte, tüm fosfat tamponlarını ve hidratlı hidroksiapatitleri 60 santigrat derecelik bir su banyosuna yerleştirerek dengeleyin. Viral nükleik asitlerin ayrılması için kullanılacak ekono kolonunu hazırlayarak bu işleme başlayın. Econo kolonunun ucuna bir vana takın ve kapalı olduğundan emin olun.

Bir pipetleyici kullanarak kolona deiyonize su ekleyin, ardından kapağı kolonun üstüne yerleştirin ve durulamak için kolonu tekrar tekrar ters çevirin. Suyu dökün ve bu yıkamayı birkaç kez tekrarlayın. Ardından, durdurma musluğunu ekon kolonundan çıkarın ve sterilize etmek için otoklavlayın.

Durdurma musluğu eriyeceği için otoklav değildir. Durdurma musluğunu iyonize suyla, ardından tekrar %70 etanol ile durulayın ve otoklavlamadan sonra kurumaya bırakın. Durdurma musluğunu değiştirin ve kapatın.

Daha sonra, bir davlumbazda çalışarak, kolona bir mililitre sigma kaplama ekleyin ve burada gösterildiği gibi bir yuvarlanma hareketiyle kolonu ters çevirerek kolon camını kaplayın. Sigma kaplama ile kaplama, nükleik asitlerin cam yüzeye yapışmasını en aza indirecektir. Ayırma işlemi sırasında bir adet tuz camı yüzeyi kaplanmıştır.

Durdurma musluğunu açın ve konik bir tüpe boşaltın. Daha sonra, sütunu dolaşan bir su banyosuna bağlamak için, sütunu bir halka standına takmak için iki kelepçe kullanın. Sirkülasyonlu su banyosundan silikon boruyu takın, böylece suyun su banyosundan akışı aşağıdan yukarıya doğru olur.

Sıcaklığı 60 santigrat dereceye ayarlayın ve dolaşımı başlatın. Uygulamada, kolon ve boru, alüminyum folyo veya köpük boru yalıtımı gibi bir yalıtım maddesine sarılacaktır. Isı kaybını en aza indirmek için bu adım burada gösterilmemiştir.

Prosedürü daha iyi görselleştirmek için durdurma musluğunu kapatın. Bir pipetleyici kullanarak 10 mililitre steril RNA serbest su ekleyin. Durdurma musluğunu açın ve suyun boşalmasına izin verin.

İkinci yıkamadan sonra tekrar yıkayın. 10 mililitre steril RNA içermeyen 0.12 molar fosfat tamponu ile iki kez durulayın ve yıkamalar arasında boşaltın. Kolon artık hidroksiapatit kromatografisi için hazırdır.

Ekon sütunu durdurma musluğunun kapalı olduğundan emin olun. Daha sonra steril iki mililitrelik serolojik pipet kullanarak, yavaşça kolonun dibine iki mililitre hazırlanmış resüspanse edilmiş rehidre hidroksi iştahı ekleyin. Sütun başlığını değiştirin.

Hidroksi iştahının 30 dakika boyunca yerçekimi kuvveti altında yerleşmesine izin verin. Bu yöntem detaylara dikkat etmeyi gerektirir. Hidroksi iştah sütunu dakikada 0,25 ila 0,5 mil hızında işlem yapar.

Bu nedenle, kurumaması için sütunu yakından takip etmek çok önemlidir. 30 dakika geçtikten sonra, tamponu bir atık kabına boşaltmak için durdurma musluğunu açın. Durdurma musluğunu kapatın ve akışı atın.

Nükleik asitleri 500 mikrolitrelik bir son hacimde 0.12 molar fosfat tamponu ile birleştirin ve 10 dakika boyunca 60 santigrat derece inkübe edin. Bu, nükleik asitleri kolonun sıcaklığına dengeleyecek ve mevcut olabilecek herhangi bir ikincil yapıyı uzaklaştırarak farklı nükleik asit türlerinin ayrılmasını artıracaktır. İki mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak, nükleik asit çözeltisini hidroksi iştahına hızlı bir şekilde uygulayın ve kolonu rahatsız etmemeye dikkat edin.

500 mikrolitrenin tamamı kolona aktığında, kurumasını önlemek için kolonun üstüne az miktarda 0.12 molar fosfat tamponu eklenebilir. Nükleik asitlerin 30 dakika boyunca hidroksi iştahına bağlanmasına izin verin. Bağlama inkübasyonunu takiben, kolonun altına 15 mililitrelik konik bir tüp yerleştirin.

Ardından durdurma musluğunu açın ve tek sarmallı DNA içeren ilk 500 mikrolitrelik numuneyi toplayın. 500 mikrolitre toplandıktan sonra durdurma musluğunu kapatın. Ardından, hidroksi iştahına altı mililitre 0.12 molar fosfat tamponu ekleyin ve sütunu rahatsız etmemeye dikkat edin.

Daha sonra durdurma musluğunu açın ve önceki adımdaki aynı 15 mililitrelik tüpte singlet sarmallı DNA içeren akışı toplamaya devam edin. Yaklaşık altı mililitre toplandıktan sonra musluğu kapatın. Vorteksleme ile kuvvetlice karıştırılan tüpe bir hacim fenol kloroform izoamil alkol çözeltisi ekleyin, ardından 15 dakika boyunca 3.500 kez G'de santrifüjleyin.

Santrifüjlemeyi takiben, tüp iki katman içerecektir. Tek DNA zincirini içeren üst emici tabakayı yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarın ve RNA'yı elüte etmek ve saflaştırmak için numuneyi oda sıcaklığında saklayın Kolondan, altı mililitre 0.20 molar fosfat tamponu ekleyin ve yeni bir 15 mililitrelik tüp kullanmadan önce akışları toplayın. Ardından bir fenol kloroform ekstraksiyonu gerçekleştirin.

Tek sarmallı DNA örneğine gelince, çift sarmallı DNA'yı kolondan çıkarmak ve saflaştırmak için altı mililitre 0.40 molar fosfat tamponu kullanarak bu işlemi tekrarlayın. Son olarak, herhangi bir kalıntı çift sarmallı DNA'nın sütununu çıkarmak için. Bu işlemi bir kez daha tekrarlayın.

Bu sefer nükleik asit örneklerini tuzdan arındırmak için altı mililitre 1.00 molar fosfat tamponu kullanarak. Her numunenin dört ila beş mililitresini, sabit açılı bir rotorda yaklaşık beş dakika boyunca 30 santigrat derecede 6.000 GS'de döndürerek 500 mikrolitreden daha azına 30.000 moleküler ağırlıklı kesme ultra hücre zarı konsantre numunesi ile donatılmış anon Ultra dört santrifüj filtre cihazına aktarın. Akışı attıktan sonra, numunelerin geri kalanını filtreye ekleyin.

RNA'lar içermeyen bir XTE tamponu ile hacmi dört ila beş mililitreye getirin. Daha sonra konsantre bir hacim elde edilene kadar tekrar döndürün. Döndürmeyi yaklaşık beş dakika takiben, filtreye dört ila beş mililitre RNA ekleyin, bir XTE tamponu serbest bırakın ve konsantre edin.

Yine, nükleik asit numunelerini tamamen tuzdan arındırmak için bu yıkamayı ve beş kez daha tekrarlayın. Numuneler tamamen konsantre edildikten ve tuzdan arındırıldıktan sonra, kalan nükleik asit numunelerini steril bir 1.7 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın. Hacim sodyum asetatın 10'da biri, iki hacim% 100 etanol ve vorteksleme santrifüjü ile iyice karıştırılmış bir mikrolitre gliko mavisi ekleyerek nükleik asitleri çökeltin.

A 28.000 GS dört santigrat derece. Kent'e 60 dakika. Peleti rahatsız etmemeye dikkat edin.

300 mikrolitre %70 etanol dönüşünü 28.000 GS oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kurumaya bırakın ve her bir fraksiyonu uygun bir RNA hacminde yeniden süspanse edin. Viral nükleik asitler M 13 MP 18, tek sarmallı DNA MS iki tek sarmallı, RNA FI altı çift sarmallı, RNA ve lambda çift sarmallı DNA'nın serbest TE tamponu eşit konsantrasyonları birleştirildi, daha sonra bu videoda gösterildiği gibi hidroksiapatit kromatografisi kullanılarak ayrıldı. Eşit konsantrasyonlarda M 13 MP 18, tek sarmallı DNA MS iki, tek sarmallı, RNA beş altı çift sarmallı, RNA ve Lambda çift sarmallı DNA, altıncı şeritte gösterildiği gibi birleştirildi ve burada görülebileceği gibi bir hidroksiapatit kolonuna uygulandı.

Tek sarmallı D-N-A-R-N-A ve çift sarmallı DNA, 0.12 molar, 0.18 molar, 0.40 molar ve 1.00 molar fosfat tamponu kullanılarak Hidroksiapatit kolonundan bağımsız olarak dahil edildi. Genom boyutlarını doğrulamak için bir KB'lık bir merdiven kullanıldı. Bu sonuçlar, bu yöntemin tek sarmallı DNA'yı, çift sarmallı DNA'yı ve RNA'yı bir fraksiyondan diğerine %9'dan daha az taşıma ile başarılı bir şekilde ayırmak için kullanılabileceğini göstermektedir.

Bu yöntem aynı zamanda burada gösterildiği gibi Chesapeake Körfezi'ndeki viral bir topluluktan izole edilen nükleik asitleri ayırmak için de kullanıldı. Tek sarmallı D-N-A-R-N-A ve çift sarmallı DNA, sırasıyla 0.12 molar, 0.20 molar ve 0.40 molar veya 1.00 molar fosfat tampon konsantrasyonları kullanılarak bağımsız olarak dahil edildi; burada görülebileceği gibi, nükleik asitlerin yaklaşık moleküler ağırlığını ve kütlesini görsel olarak doğrulamak için birinci şeritte yüksek kütleli DNA merdiveni ve ikinci şeritte bir KB merdiveni kullanıldı, çift sarmallı DNA, Chesapeake Bay Verio planktonundan ekstrakte edilen baskın nükleik asit tipiydi. Bu videoyu izledikten sonra, hidroksiapatit kromatografisi kullanılarak nükleik asitlerin karışık bir viral topluluktan nasıl ayrılacağını iyi anlamış olmalısınız.

Bu, Hidroksiapatit kolonunun ve nükleik asitlerin hazırlanmasını, çeşitli konsantrasyonlarda fosfat tamponu kullanılarak nükleik asitlerin ayrılmasını ve yanılsamasını ve tuzdan arındırılmasını ve ayrılmadan sonra nükleik asitlerin konsantre edilmesini içerir.