Name: Tek iplikli DNA, çift iplikli DNA ve RNA Hidroksiapatit Kromatografisi kullanarak bir Çevre Viral Topluluk ayrılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 46 s
Description: Öğrenin, çevresel viral topluluklardan tek iplikli DNA, çift iplikli DNA ve RNA'yı hidroksiapatit kromatografisi kullanarak nasıl ayıracağınızı. Bu yöntem viral çeşitlilik ve işlevsel potansiyel çalışmalarını kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu araştırma, Bilim Ofisi (BER), ABD Enerji Bakanlığı, hayır Anlaşması Kooperatifi tarafından desteklenmiştir. De-FC02-02ER63453, Ulusal Bilim Vakfı Mikrobiyal Genomu Sıralama Programı (ödül numaraları 0.626.826 ve 0.731.916). Biz çevresel örnek toplama ile yaptığı yardım için teknik uzmanlık ve danışmanlık ve K. Eric Wommack John Cam teşekkür ederiz.

1. Çözeltilerin Hazırlanması Hidroksiapatit kromatografi gerçekleştirmeden önce, fosfat tamponlar hazırlıklı olmak gerekir ve hidroksiapatit düzgün sulu olmalıdır. <ol><li> 1M Fosfat Çözüm pH 6,8: 1L şişesi, steril, DEPC ile tedavi edilen H 2 O. 1L sodyum fosfat tekbazlı 119.98g çözülür Steril, DEPC ile tedavi edilen H 2 O. 1L sodyum fosfat dibazik 141.96g eriterek 1L balonuna 1M sodyum fosfat dibazik çözüm hazırlayın 1:1 oranında mono-ve di-çözümleri birleştirin. Bir manyetik karıştırıcı kullanılarak bir heyecan plaka ve karışımı üzerine yerleştirin balonu. PH 6.8 sodyum hidroksit (pH artırmak için) ya da fosforik asit (pH azaltmak için) ekleyerek ayarlayın. </li><li> 0.12M Fosfat Tamponu: 500ml şişesi, 1M Fosfat Çözüm, pH 6.8, 2.5ml% 10 sodyum dodesil sülfat (SDS) ve 0,5 M EDTA, 5ml, 30ml birleştirir. 225ml hacmi steril, DEPC tedavi H2O ekleyin. PH 6.8 ayarlayın. 250ml için steril, DEPC tedavi H2O ekleyin. Otoklav. </li><li> 0.18M Fosfat Tamponu: 500ml şişesi, 1M Fosfat Çözüm, pH 6.8, 2.5ml% 10 sodyum dodesil sülfat (SDS) ve 0,5 M EDTA, 5ml, 45ml birleştirir. 225ml hacmi steril, DEPC ile tedavi edilen H 2 O ekleyin. PH 6.8 ayarlayın. 250ml için steril, DEPC ile tedavi edilen H 2 O ekleyin. Otoklav. </li><li> 0.20M Fosfat Tamponu: 500ml şişesi, 1M Fosfat Çözüm, pH 6.8, 2.5ml% 10 sodyum dodesil sülfat (SDS) ve 0,5 M EDTA, 5ml, 50ml birleştirmek. 225ml hacmi steril, DEPC ile tedavi edilen H 2 O ekleyin. PH 6.8 ayarlayın. 250ml için steril, DEPC ile tedavi edilen H 2 O ekleyin. Otoklav. </li><li> 0.40 M Fosfat Tampon: 1M Fosfat Çözüm, pH 6.8, 2.5ml% 10 sodyum dodesil sülfat (SDS) ve 0,5 M EDTA, 5ml 100 ml, 500 ml cam şişe içinde birleştirir. 225ml hacmi steril, DEPC ile tedavi edilen H 2 O ekleyin. PH 6.8 ayarlayın. 250ml için steril, DEPC ile tedavi edilen H 2 O ekleyin. Otoklav. </li><li> "1.00m Fosfat Tampon" (bu çözüm gerçek fosfat konsantrasyonu 0,91 M): 500ml balon, 30 ml% 10'luk sodyum dodesil sülfat (SDS) 1M Fosfat Çözüm pH6.8, 2.5ml birleştirmek ve 5ml EDTA 0.5M. 225ml hacmi steril, DEPC tedavi H2O ekleyin. PH 6.8 ayarlayın. 250ml için steril, DEPC ile tedavi edilen H 2 O ekleyin. Otoklav. </li><li> Hidroksiapatit hidrasyon: hidroksiapatit 1g dışarı Ağırlık ve 50ml tüp ekleyin. Hidroksiapatit 0.12M fosfat tamponu 6ml ekleyin ve karışımı için ters. Önce 60 sıcaklık getirmek ° C ve iyice karıştırın. 4 ° C uzun süre saklayın </li><li> Kullanmadan önce, 60 ° C'de tüm fosfat tampon ve sulu hidroksiapatit dengelenmesi </li></ol> 2. Econo-Kolon hazırlanması <ol><li> Stopcock kapatın. , Sütun ve sürekli tersini şişeden sütun birkaç kez deiyonize H 2 O ile durulayın . </li><li> Econo-sütun stopcock çıkarın ve sütun otoklavda sterilize etmek. </li><li> Değiştirin ve valfli yakın. Econo-sütun steril ve ceket tüm cam yüzeyler için Sigmacote 1 ml ekleyin. Stopcock ve süzün açın. </li><li> Dolaşan su banyosu sütun takın ve 60 sıcaklığını ayarlamak ° C Ambalaj, alüminyum folyo veya köpük boru izolasyonu gibi bir yalıtım maddesi sütun sütun boyunca ısı kaybını en az miktarda einsure için tavsiye edilir. </li><li> Steril, RNaz-0.12M Fosfat Tampon sonra iki kez steril, RNaz-serbest H 2 O Econo-sütun ile iki kez durulayın. </li></ol> 3. Hydroxypaptite Kromotografisi <ol><li> Emin olun stopcock kapalı, yavaş yavaş 2ml steril bir serolojik pipet kullanarak önceden hazırlanmış, yeniden süspanse hidroksiapatit Econo sütunun alt 2ml ekleyin. </li><li> Hidroksiapatit 30 dakika boyunca yerçekimi kuvveti altında yerleşmek için izin verin. </li><li> Sütun ve yakın stopcock tampon boşaltın. 60 ° C bir ısı bloğu veya su banyosunda 10 dakika için son hacim 500 ul ve inkübe 0.12M fosfat tamponu ile nükleik asitlerin birleştirin </li><li> Sütun rahatsız değil emin olun bir 2ml serolojik pipet kullanarak hidroksiapatit 0.12M fosfat tamponunda hazırlanmış nükleik asitlerin hemen geçerlidir. </li><li> Nükleik asitler, 30 dakika boyunca hidroksiapatit bağlamak için izin verin. </li><li> Sütununun altında 15ml tüp yeri stopcock, açık ve ssDNA içeren ilk örnek toplamak. Stopcock kapatın. </li><li> 0.12M fosfat tamponu, sütun rahatsız stopcock açmak ve önceki adımda 15ml tüp tek iplikli DNA toplamak için değil emin hidroksiapatit 6ml ekleyin. Stopcock kapatın. </li><li> Kloroform:: 1 hacim fenol izoamil alkol (25:25:1 v / v / v) tüp çözüm kuvvetlice karıştırın ve 15 dakika 3500 xg'de santrifüj. Yeni bir 15ml tüp supernatant içeren ssDNA aktarın. </li><li> 6ml e 0.20M fosfat tamponu kullanılarak 3.76 ve 3.87 tekrarlayın.ud ve arındırır RNA sütun koleksiyonu için yeni bir 15ml tüp kullandığınızdan emin olun. </li><li> 0.40M fosfat tamponu 6ml kullanarak yeni koleksiyonu için 15ml tüp kullanmak için emin olun sütun dsDNA Zehir ve arındırmak için 3.76 ve 3.87 tekrarlayın. </li><li> Koleksiyonu için yeni bir 15ml tüp kullanmak için emin olmak için herhangi bir kalıntı dsDNA sütun şerit 1.00m fosfat tamponu 6ml kullanarak 3.76 ve 3.87 tekrarlayın. </li></ol> 4. Nükleik Asit Örnekleri tuzsuzlaştırma <ol><li> Örnek transfer 4-5ml Amicon Ultra-4 Ultracel membran kesilmiş 30.000 molekül ağırlığı ile donatılmış santrifüj filtre cihazı. </li><li> 6.000 xg, 30 iplik &lt;500μl örnek Konsantre ° C, 5 dakika sabit açılı rotor (ya da konsantre hacmi elde edene kadar). Akış atın. </li><li> Örnek (ler) kalan Amicon Ultra-4 santrifüj filtre cihazı ve 4-5ml Rnase ücretsiz 1X TE Tampon ile ses getirmek. </li><li> 6.000 xg, 30 iplik &lt;500μl örnek Konsantre ° C, 5 dakika sabit açılı rotor (ya da konsantre hacmi elde edene kadar). Akış atın. </li><li> Amicon Ultra-4 santrifüj filtre cihazı için 4-5ml Rnase ücretsiz 1X TE Buffer ekleyin. 6.000 xg, 30 santrifüj &lt;500μl örnek Konsantre ° C, 5 dakika sabit açılı rotor (ya da konsantre hacmi elde edene kadar). Akış atın. </li><li> Nükleik asit örnek (ler) tamamen desalt adım 4,5 ek bir 5 kez tekrarlayın. </li><li> Kalan numune (ler), steril bir 1.7ml Eppendorf tüpüne aktarın. 1/10th hacmi 3M sodyum asetat, pH 7.0,% 100 etanol iki cilt ve Glycoblue, 1μl ekleyin. Vorteks ile iyice karıştırın. </li><li> 28.000 xg, 4 ° C, 60 dakika santrifüjleyin. Durusu pelet rahatsız değil emin olun. % 70 etanol 300μl ekle. 28.000 xg, oda sıcaklığında 10 dakika Spin. Durusu, kuru ve Rnase ücretsiz TE tampon uygun bir hacmi her fraksiyonu tekrar süspansiyon haline getirin. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Şekil 1, karışık bir viral birleşmesi damıtmak ssDNA, dsDNA ve RNA nükleik asitlerin hidroksiapatit kromatografisi kullanılarak sunulan yöntemleri özetlemektedir . Bu yöntem, nükleik asitlerin negatif yüklü fosfat omurgası ve pozitif yüklü Ca 2 arasındaki ücret etkileşim patlatır + iyonları hidroksiapatit mevcut ve artan fosfat tamponu konsantrasyonları ile nükleik asit alt tiplerinin etkin fraksiyonasyon (ssDNA, dsDNA ve RNA) sağlar 12. Bilinen ssDNA (M13mp18), dsDNA (lambda) ve RNA "topluluk" in vitro bir hidroksiapatit fraksiyonasyon (MS2 ve phi6) viral genomların Şekil 2'de gösterilmiştir. Nükleik asitler, eşit konsantrasyonlarda birlikte hidroksiapatit sütuna uygulanan ve giderek artan konsantrasyon fosfat tampon kullanarak kolonda sürüklenecektir. Her nükleik asit alt tipi,% 9 daha az sonraki bir fraksiyonu üzerinde taşımak diğerlerinden bağımsız elutes. Chesapeake Bay toplanan bir viral toplumdan izole edilen nükleik asitler bu tekniğin uygulama Şekil 3'te gösterilmiştir. Saflaştırılmış virüsleri izole toplam nükleik asit verimi hidroksiapatit sütun uygulandı . Genomik malzeme ssDNA, RNA ve dsDNA oluşan bağımsız sırasıyla 0.12M, 0.20M ve fosfat tampon 0.40M/1.00M konsantrasyonları ile yıkandı. Çift iplikli DNA, 0.40M ve 1.00m fosfat konsantrasyonları yıkandı, ve bu durumda, ssDNA ve RNA genotipler karşılaştırıldığında bu viral bir topluluk hakim. Bu gözlem, geri kazanılabilir nükleik asitlerin çoğunluğu dsDNA 13 beklenen viral deniz toplum kompozisyon ve haliç ortamları ile tutarlı . <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 nükleik asitlerin fraksiyonasyon hidroksiapatit kromatografi yöntemi akış diyagramı. 0.12M fosfat tamponu içinde hazırlanan ssDNA, dsDNA ve RNA karışımı 60 ° C dereceye kadar ısıtılır ve 60 yaşında bir sabit tutulan bir hidroksiapatit sütun uygulanır ° C su banyosu dolaşan kullanarak. Nükleik asitler (ssDNA, RNA ve dsDNA) fosfat içeren bir tampon artan konsantrasyonları ile hidroksiapatit kolonda sürüklenecektir. Bu rakam Amerikan Mikrobiyoloji Derneği izni ile yeniden ve orijinal Andrews-Pfannkoch ark yer aldı. 2010 12. <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 hidroksiapatit kromatografisi kullanarak bilinen viral nükleik asitlerin ayrılması. Eşit konsantrasyonda M13mp18 ssDNA, MS2 ssRNA, phi6 dsRNA ve lambda dsDNA (şerit 2-5, sırasıyla) kombine (şeritli 6) ve hidroksiapatit bir sütun uygulanmıştır. Single-iplikli DNA (M13mp18), RNA (MS2/phi6) ve dsDNA (lambda) 0.12M (şerit 8), 0.18M (şerit 9) ve 0.40M/1.00M (10 şeritli) kullanarak hidroksiapatit sütun bağımsız yıkandı, . 1KB merdiveni (şerit 1, 7) genom boyutları onaylamak için kullanılır oldu. Bu rakam Amerikan Mikrobiyoloji Derneği izni ile yeniden ve orijinal Andrews-Pfannkoch ark yer aldı. 2010 12. <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 Chesapeake Körfezi içinde bir toplumdan izole viral nükleik asitlerin ayrılması. Nükleik asitlerin, izole edilmiş ve hidroksiapatit bir sütun uygulanmıştır. ssDNA (şeritli 0.12M), RNA (şeritli 0.20M) ve dsDNA (şerit 0.40M/1.0M) bağımsız olarak sırasıyla, 0.12M, 0.20M ve 0.40M/1.00M fosfat tampon konsantrasyonu kullanılarak yıkandı,. Hi Kitle DNA Ladder (şeritli L1) ve 1KB Merdiven (şeritli L2), görsel, nükleik asitlerin yaklaşık moleküler ağırlık ve kütle onaylamak için kullanılır. Bu rakam Amerikan Mikrobiyoloji Derneği izni ile yeniden ve orijinal Andrews-Pfannkoch ark yer aldı. 2010 12.

<ol><li>Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokaryotes%3A+The+Unseen+Majority%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prokaryotes: The Unseen Majority.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6578-65 (1998).</li>
<li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophages%3A+evolution+of+the+majority%5BTitle%5D)+AND+%22Theor+Popul+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacteriophages: evolution of the majority.</a> Theor Popul Biol. 61, 471-471 (2002).</li>
<li>Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophages%3A+Evolution+of+the+Majority%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Bacteriophages: Evolution of the Majority.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 127-127 (2004).</li>
<li>Dinsdale, E. A., Edwards, R. A., Hall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Metabolic+Profiling+of+Nine+Biomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional Metabolic Profiling of Nine Biomes.</a> Nature. 455, 830-830 (2008).</li>
<li>McDaniel, L., Breitbart, M., Mobberley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+Analysis+of+Lysogeny+in+Tampa+Bay%3A+Implications+for+Prophage+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Metagenomic Analysis of Lysogeny in Tampa Bay: Implications for Prophage Gene Expression.</a> PLoS ONE. 3, e3263-e3263 (2008).</li>
<li>Williamson, S. J., Rusch, D. B., Yooseph, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sorcerer+II+Global+Ocean+Sampling+Expedition%3A+Metagenomic+Characterization+of+Viruses+within+Aquatic+Microbial+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: Metagenomic Characterization of Viruses within Aquatic Microbial Samples.</a> PLoS ONE. 3, e1456-e1456 (2008).</li>
<li>Lang, A. S., Rise, M. L., Culley, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Viruses+in+the+Sea%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">RNA Viruses in the Sea.</a> FEMS Microbiol Rev. 33, 295-295 (2009).</li>
<li>Ng, T. F., Manire, C., Borrowman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+Novel+Single-Stranded+DNA+Virus+from+a+Sea+Turtle+Fibropapilloma+by+using+Viral+Metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Discovery of a Novel Single-Stranded DNA Virus from a Sea Turtle Fibropapilloma by using Viral Metagenomics.</a> J. Virol. 83, 2500-2500 (2009).</li>
<li>Rosario, K., Duffy, S., Breitbart, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Circovirus-like+Genome+Architectures+Revealed+by+Environmental+Metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Diverse Circovirus-like Genome Architectures Revealed by Environmental Metagenomics.</a> J Gen Virol. 90, 2418-2418 (2009).</li>
<li>Culley, A. I., Lang, A. S., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+Analysis+of+Coastal+RNA+Virus+Communities%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus Communities.</a> Science. 312, 1795-1795 (2006).</li>
<li>Bernardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromotography+of+Nucleic+Acids+on+Hydroxyapatite%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromotography of Nucleic Acids on Hydroxyapatite.</a> Nature. 209, 779-779 (1965).</li>
<li>Andrews-Pfannkoch, C., Fadrosh, D. W., Thorpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyapatite-Mediated+Separation+of+Double-Stranded+DNA%2C+Single-Stranded+DNA+and+RNA+Genomes+from+Natural+Viral+Assemblages%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Hydroxyapatite-Mediated Separation of Double-Stranded DNA, Single-Stranded DNA and RNA Genomes from Natural Viral Assemblages.</a> Applied and environmental microbiology. 76, 5039-5039 (2010).</li>
<li>Wommack, K. E., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virioplankton%3A+Viruses+in+Aquatic+Ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64, 69-69 (2000).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan hidroksiapatit kromatografi metodolojisinin amacı, toplumun toplam nükleik asit kompozisyonu okumak için karışık viral toplulukları, nükleik asitlerin fraksiyonasyon için son derece verimli ve güçlü bir araç. Genellikle, ssDNA, RNA ve dsDNA yaklaşık ~ 0and 0.40M sırasıyla daha fazla sütun pho fosfat tamponu konsantrasyonları Zehir. Ancak, bilinen nükleik asitler (örneğin ekili bir virüs hazırlık) kullanarak her bir hazırlık test etmek için önemli böylece hidroksiapatit her hazırlanması, biraz dah...

<table border="1"><tbody><tr><th> Malzeme Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog Numarası </th><th> Katalog Numarası </th></tr><tr><td> Econo-Kolon </td><td> Bio-Rad </td><td> 737-0717 </td><td> 0.7cm ID paket / 2 </td></tr><tr><td> Hidroksiapatit </td><td> Bio-Rad </td><td> 130-0520 </td><td> DNA Sınıf Bio-Gel HTP Jel, 100g/td&gt; </tr><tr><td> Sodyum Fosfat, mono </td><td> VWR </td><td> VW1497-01 </td><td> Monohidrat, Kristal 500g </td></tr><tr><td> Sodyum Fosfat, Dibazik </td><td> VWR </td><td> VW1496-01 </td><td> Susuz, Toz 500g </td></tr><tr><td> DEPC-tedavi Su </td><td> Invitrogen </td><td> AM9922 </td><td> 1L </td></tr><tr><td> % 10 SDS Çözüm </td><td> Invitrogen </td><td> 24730-020 </td><td> Ultrapure, 1l </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> AM9262 </td><td> pH 8.0, 1L </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> SL2-25ml </td><td></td></tr><tr><td> 2ml serolojik pippette </td><td> VWR </td><td> 89130-884 </td><td> Polistiren, Steril </td></tr><tr><td> BD Falcon Santrifüj Tüpleri </td><td> VWR </td><td> 21008-936 </td><td> 15ml, Steril </td></tr><tr><td> Fenol: Kloroform: izoamil Alkol (25:24:1 v / v / v) </td><td> Invitrogen </td><td> 15593-031 </td><td> Ultrapure, 100ml </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-4 Santrifüj Aygıt </td><td> Millipore </td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel-30 membran </td></tr><tr><td> 20X TE Tampon, Rnase ücretsiz </td><td> Invitrogen </td><td> T11493 </td><td> 100ml </td></tr><tr><td> Glycoblue </td><td> Invitrogen </td><td> AM9516 </td><td> 15mg/ml </td></tr></tbody></table>

tek iplikli dna, çift iplikli dna ve rna hidroksiapatit kromatografisi kullanarak bir Çevre viral topluluk ayrılması

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Virüsler, özellikle bakteriyofajlar (faj), Dünya&#39;nın 1,2 en çok sayıda biyolojik varlıklar . Virüsler konak hücre bolluğu ve çeşitliliği, besin bisiklet modüle katkıda hücre fenotipi ev sahipliği değiştirebilir ve lateral transferi yoluyla genleri 3 konak hücre ve viral toplulukların evrim etkisi. Çeşitli çalışmalar, virüsler ve doğal ortamlarında çeşitli fonksiyonel potansiyeli şaşırtıcı genetik çeşitlilik sermiştir. Taksonomik çeşitlilik ve üyeleri, tek iplikli DNA (ssDNA), çift iplikli DNA (dsDNA) ve RNA genotipleri 4-9 içeren karmaşık viral toplulukları fonksiyonel bir potansiyel çalışma Metagenomic teknikleri kullanılmıştır. Şu kütüphane inşaatı çevre DNA içeren virüsler veya RNA içeren çalışmada kullanılan protokolleri nontargeted 10 şablonları kaldırmak için bir başlangıç ​​nukleaz tedavisi gerektirir. Ancak, kapsamlı bir anlayış, virüs topluluk ve virüs çeşitliliği kolektif gen kompleman genom kompozisyonu ne olursa olsun, tüm üyelerinin bilgi gerektirir. Nükleik asit alt tipleri saflaştırılmış Fraksiyonu, toplumun genetik imza bir alt kümesi ödün vermeden viral toplulukları incelemek için etkili bir mekanizma sağlar. Hidroksiapatit, kristal formu, kalsiyum fosfat, 1960&#39;larda 11 yılından bu yana, nükleik asitlerin ayrılması, protein ve mikropların yanı sıra istihdam edilmiştir . + Pozitif yüklü Ca 2 arasındaki ücret etkileşimini exploit hidroksiapatit ve nükleik asit alt tiplerinin negatif yüklü fosfat omurgası iyonlar, tercihen diğerlerinden bağımsız olarak her bir nükleik asit alt tipi Zehir mümkündür. Bu stratejinin istihdam Biz son zamanlarda, DNA dizi analizi 12 hazırlanması ssDNA, dsDNA ve RNA içeren virüsler bağımsız damıtmak genomların . Burada, hidroksiapatit kromatografileri kullanarak karışık viral toplulukları ssDNA, dsDNA ve RNA viral nükleik asitlerin fraksiyonasyon ve kurtarma için bir yöntem mevcut.

Biz çevre viral toplulukların tek iplikli DNA, çift iplikli DNA ve RNA molekülleri ayırmak için etkili bir yöntem açıklanmaktadır. Nükleik asitler, fosfat içeren tamponlar artan konsantrasyonları ile hidroksiapatit kromatografisi kullanılarak fraksiyone. Bu yöntem, tüm çevre örneklerinden viral nükleik asit türleri izolasyonu izin verir.

Tek iplikli DNA, çift iplikli DNA ve RNA Hidroksiapatit Kromatografisi kullanarak bir Çevre Viral Topluluk ayrılması

Virüsler, özellikle de bakteriyofajlar (fajlar), Dünya üzerindeki en sayıca fazla biyolojik varlıklardır1,2. Virüsler, konak hücre bolluğunu ve çeşitliliğini modüle eder, ...

Bu video, karışık viral toplulukların nükleik asit bileşimlerine göre ayrılmasına yönelik bir prosedürü göstermektedir. Bu yöntem, karmaşık viral toplulukların taksonomik çeşitliliğinin ve fonksiyonel potansiyelinin incelenmesine olanak tanır. Burada nükleik asitlerin ayrılmasında kalsiyum fosfatın kristal bir formu olan hidroksiapatit kullanılmaktadır.Öncelikle, bir Hidroksiapatit kolonu doldurulur ve dengelenir; ardından saflaştırılmış viral nükleik asitler kolona uygulanır. Hidroksiapatitin pozitif yüklü kalsiyum iyonları ile nükleik asit alt tiplerinin negatif yüklü fosfat omurgası arasındaki yük etkileşimi, nükleik asitlerin kolona bağlanmasını sağlar. Daha sonra, tek sarmallı DNA/RNA ve çift sarmallı DNA, farklı konsantrasyonlardaki fosfat tamponları ile sırayla elüe edilir. Elde edilen nükleik asitler, görselleştirme, miktar belirleme ve DNA dizileme yoluyla tanımlama hazırlığı amacıyla tuzdan arındırılır ve konsantre edilir; agaroz jel elektroforezi, nükleik asit türlerinin %9'dan daha az taşıma (carryover) ile ayrılabileceğini doğrular.Böylece bu yöntem, viral toplulukların çeşitliliğinin ve fonksiyonel kapasitesinin değerlendirilmesine olanak sağlar. Merhaba, ben Doug Fro

separation-single-stranded-dna-double-stranded-dna-rna-from-an

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz sezyum klorür yoğunluk gradiyenti santrifüj arıtma için 0.22 mikron Sterivex filtreler, konsantre planktonik biyokütle yüksek molekül ağırlıklı genomik DNA çıkarılması için bir metodu tanımlar.

0.22 mcM Sterivex Filtreler ve Sezyum Klorür Yoğunluk Gradient Santrifüj DNA Ekstraksiyon

Biz hypersaline mikrobiyal paspaslar yüksek molekül ağırlıklı DNA ayıklamak için geliştirilmiş bir protokol sağlar. Mikrobiyal hücrelerin DNA ekstraksiyonu ve saflaştırma mat matris önce ayrılır. Bu konsantrasyonları, kalite ve DNA boyutunu artırır. Bu protokol, diğer refrakter numuneler için kullanılabilir.

Mikrobiyal Paspas Yüksek Moleküler Ağırlıklı DNA çıkarımı

Isotachophoresis (ITP) toksini tanıma ve numune hazırlama kadar uygulamaları ile sağlam bir elektrokinetik ayırma ve zenginleştirme tekniktir. Ayırma ve küçük moleküller ve hücre kültürü lizatı nükleik asitlerin saflaştırılması tespiti: Biz ITP fiziksel prensipleri ve iki özel örnek uygulamalar için bu tekniği uygulayarak metodolojisi gözden geçirin.

İyonların ayrılması ve Nükleik Asit Saflaştırılması için on-chip Isotachophoresis

Tek Virüs Genomik (SVG) tek Virons en genom izole etmek ve yükseltmek için bir yöntemdir. Karışık malzeme grubuyla viral süspansiyonları böylece virion yakalama ve alt işleme sırasında genom kesme azaltarak, agaroz içeren ayrık kuyu ile bir mikroskop lamı üzerine akım sitometri kullanılarak sıralanır. Tüm genom amplifikasyonu sekanslama için uygun olan genomik malzeme ile sonuçlanan birden fazla yer değiştirme amplifikasyonu (MDA) kullanılarak elde edilir.

&#39;Tek Virüs Genomik&#39; kullanarak Tek viryonlar İzolasyonu ve Genom Analizi

Kaynak: Dembowski, J. A., et al. Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins. J. Vis. Exp. (2017).Bu video, klik kimyası ve manyetik boncuk saflaştırması kullanarak hücre çekirdeklerinden protein-viral DNA komplekslerinin izolasyonunu göstermektedir. Protokol; viral genomların alkin-modifiyeli nükleotidlerle işaretlenmesini, bir klik reaksiyonu aracılığıyla biyotinilasyonu ve streptavidin kaplı manyetik boncuklara bağlanmayı içerir. Yıkama ve ısı...

Viral DNA-Protein Komplekslerinden Proteinlerin İzolasyonu

Örneğin, kistik fibroz hava yolunu kullanarak, el yazması bir hayvan ile ilişkili örneklerde mikrobik ve virüs toplulukları karakterize metagenomic ve metatranscriptomic yaklaşımların bir kombinasyonu içeren kapsamlı bir akışını göstermektedir.

Saf olmayan Arındırıcı: Sıralama Metagenomes ve Metatranscriptomes Kompleksi Hayvan ilişkili Örneklerinden

Burada, uzak deniz ortamlarında organik ve inorganik besin mevcudiyetini ve mikrobiyal ve viral toplulukların bolluğunu ve yapısını değerlendirmek için kapsamlı bir protokol sunuyoruz.

Su Kimya ve Deniz Mikrobiyoloji A Field Guide - Okyanusu&#39;nda gaybı Oyuncular çözülüyor

Biz 16S rRNA gen sıralama amplikon kullanarak bakteri topluluklarının karakterizasyonu için sürüntü nükleik asidin çıkarmak için etkili, sağlam ve uygun maliyetli bir yöntem açıklanmaktadır. yöntem birden fazla örnek türleri için ortak bir işleme yaklaşımı sağlar ve alt analitik süreçlerin bir dizi barındırmaktadır.

Bakteriyel Topluluk Karakterizasyonu Verimli Nükleik Asit Ekstraksiyonu ve 16S rRNA gen Sıralama

Bu iletişim kuralı, özellikle etiket ve seçmeli olarak viral genom ilişkili proteinler karakterizasyonu için virüslü hücrelerinden viral DNA izole etmek için hedeftir.

Teşhis edilmesi için kullanılan ilişkili Viral ve hücresel proteinler Viral DNA'ın arıtma

Bu el yazması, optimize edilmiş bir heparin bazlı afinite kromatografisi yöntemi kullanılarak adeno ile ilişkili viral vektörlerin üretilmesi ve saflaştırılması için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır. Ultrasantrifüjleme ihtiyacını ortadan kaldıran basit, ölçeklenebilir ve uygun maliyetli bir yaklaşım sunar. Elde edilen vektörler, klinik öncesi çalışmalarda değerlerini kanıtlayan yüksek saflık ve biyolojik aktivite sergiler.

Adeno ile İlişkili Viral Vektörlerin Tek Adımlı ve Yarı Otomatik Heparin Afinite Kromatografisi Protokolü ile İzolasyonu

Bu protokol, plazmid DNA çıkarımını hızlandırmak için maliyet etkin bir yöntem tanımlar. Standart sallanan kovalı plaka rotorlarıyla uyumlu özel 3D baskılı raflar kullanılarak, araştırmacılar aynı anda 48 döner kolonunu kapaklı veya 116 döner kolonunu kapaksız işleyebilir; bu da manuel mikrosantrifüj yöntemlerine kıyasla kullanım süresini önemli ölçüde azaltmaktadır.

24 kuyu rafları kullanarak orta verimlilikli kolon DNA çıkarımı

Öğrenin, çevresel viral topluluklardan tek iplikli DNA, çift iplikli DNA ve RNA'yı hidroksiapatit kromatografisi kullanarak nasıl ayıracağınızı. Bu yöntem viral çeşitlilik ve işlevsel potansiyel çalışmalarını kolaylaştırır.

Tek iplikli DNA, çift iplikli DNA ve RNA Hidroksiapatit Kromatografisi kullanarak bir Çevre Viral Topluluk ayrılması

Daha fazla video keşfet