Fare Hipokampal Nöronlarında Sinaptik Vezikül Endositozunun Transmisyon Elektron Mikroskobik Görüntülenmesi

Fare hipokampal nöronlarını yaban turpu peroksidaz veya HRP içeren yüksek potasyumlu bir tamponla tedavi ederek başlayın.

Yüksek potasyum, presinaptik nöronları depolarize ederek sinaptik vezikül ekzositozunu tetikler. Nöronlar daha sonra HRP'yi yeni oluşan veziküllere dahil ederek endositoz yoluyla sinaptik vezikül zarlarını alır. Nöronları glutaraldehit ile sabitleyin ve fazla glutaraldehiti çıkarmak için yıkayın.

Hidrojen peroksit ve elektron yoğun çökeltiler oluşturmak üzere HRP tarafından oksitlenen kromojenik bir substrat ekleyin. Reaksiyona girmemiş alt tabakayı çıkarmak için yıkayın.

Membran kontrastını artırmak için osmiyum tetroksit ile muamele edin, ardından fazla reaktifi yıkayın. Ardından, organel kontrastını artırmak için uranil asetat ekleyin.

Artan etanol konsantrasyonları kullanarak nöronları kurutun ve reçineye gömün.

Hücre yoğun bölgeleri mikroskobik olarak tanımlayın ve bunları çıkarın. Ardından ultra ince bölümler hazırlayın.

Bir bölümü bakır bir ızgaraya aktarın ve kontrast maddelerle boyayın.

Transmisyon elektron mikroskobu kullanıldığında, HRP içeren veziküller elektron yoğun yapılar olarak görünür.

90 saniye boyunca oda sıcaklığında her bir oyuğa 1.5 mililitre yüksek potasyum stimülasyon çözeltisi ekleyerek hipokampal nöron kültürünü uyarın. Bu adımda, pH 7.4'te 0.1 molar sodyum kakodilat tamponu hazırlayın. Hücreleri% 4 glutaraldehit ile 0.1 molar sodyum kakodilat tamponunda oda sıcaklığında en az bir saat sabitleyin.

Daha sonra, hücreleri her seferinde yedi dakika boyunca 0.1 molar sodyum kakodilat tamponu ile üç kez yıkayın. Bunu takiben, DAB çözeltisini hazırlayın ve 0.22 mikrometre filtre ile süzün. Daha sonra, hücrelere 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca 1.5 mililitre DAB çözeltisi uygulayın.

Daha sonra, hücreleri her seferinde yedi dakika boyunca 0.1 molar sodyum kakodilat tamponu ile üç kez yıkayın. Fiksasyon sonrası olarak, nöronları 0.1 molar sodyum kakodilat tamponunda 1.5 mililitre% 1 osmiyum tetroksit ile dört santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin.

Daha sonra, nöronları her seferinde yedi dakika boyunca 1.5 mililitre 0.1 molar sodyum kakodilat tamponu ile üç kez yıkayın. Daha sonra, sodyum asetat ve buzlu asetik asit ile 0.1 molar sodyum asetat tamponu hazırlayın. Hücreleri her seferinde yedi dakika boyunca 1.5 mililitre 0.1 molar asetat tamponu ile üç kez yıkayın.

Bundan sonra, hücreleri 1.5 mililitre% 1 uranil asetat ile 0.1 molar asetat tamponunda dört santigrat derecede 1 saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, hücreleri her seferinde yedi dakika boyunca 1.5 mililitre 0.1 molar asetat tamponu ile üç kez yıkayın. Bir çeker ocakta, nöronal kültürü her yıkamada yedi dakika boyunca %50, %70 ve %90 etanol içeren tek 1.5 milileter yıkama ile kurutun, ardından her seferinde yedi dakika boyunca 1.5 mililitre %100 etanol ile üç yıkama yapın.

Ardından, epoksi reçineyi oluşturun ve iyice karıştırın ve hava kabarcıklarını gidermek için vakum altında saklayın. Etanolü oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerinde etanol içinde% 50 epoksi reçine ile, ardından% 70 epoksi reçine ve etanol ile bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika değiştirerek numuneyi sızatın.

Epoksi reçine çözeltisini %100 epoksi reçine ile değiştirin ve 50 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. İki adet taze %100 epoksi reçine değişimi yapın. Her değişim 50 santigrat derecede bir saat inkübe edilir. Ardından, taze %100 epoksi reçine ekleyin ve gece boyunca 50 santigrat derecede ve ardından 36 saatten fazla 60 santigrat derecede sertleşmesine izin verin.

Daha sonra, her bir numuneyi kuyumcunun el testeresi ile çok kuyulu plakadan çıkarın. Ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu kullanarak, yoğun hücre konsantrasyonlarına sahip ilgi alanlarını seçin. Ardından, kesit almak için 4 x 5 x 8 milimetre küp blokları kesin. Daha sonra, numunelerin kontrastını iyileştirmek için bölümleri 15 dakika boyunca %1 sulu uranil asetat ve ardından 5 dakika boyunca %3 sulu kurşun sitrat ile daldırarak karşı boyayın.