Floresan lipofilik boyalar kullanılarak Drosophila motor nöronlarının retrograd etiketlenmesi

Etrafında bant bulunan bir cam slayta sabitlenmiş parçalanmış bir Drosophila embriyosu ile başlayın.

Sineğin motor nöronları görselleştirme için floresan olarak etiketlenmiştir.

Mikroskop kullanarak embriyoyu görselleştirin ve embriyonun yanına yeşil floresan lipofilik boya dolu bir mikropipet yerleştirin.

Ardından, floresan moduna geçin ve motor nöronun kas kavşağında motor nöronun aksonal ucunu bulun.

Parlak alan moduna geçin, hedef aksonun ucunu pipetle temas ettirin, bir boya damlası bırakın ve ardından inkübe edin.

Lipofilik yapıları ve aksonal çevreleri nedeniyle, boyalar hedeflenen aksonun lipid açısından zengin zarına seçici olarak girer.

Zamanla, boya geriye doğru hareket eder, aksonal lipid çift tabakası boyunca nöronal gövdeye doğru geriye doğru hareket eder ve nöronal çıkıntıları etiketler.

Bandı slayttan çıkarın ve bir lamel yerleştirin.

Slaydı konfokal mikroskop altında gözlemleyin.

Retrograd etiketli hedef nöron, ayrıntılı nöronal morfoloji ve projeksiyonları gösteren yeşil floresan renkte görünür.

Embriyonun iç dokularına zarar vermemeye dikkat ederek, embriyoyu vitellin zarından banttan camın üzerine sürüklemek için diseksiyon mikroskobu altında bir cam iğne kullanın. Daha sonra, yüzeyindeki tek bir embriyonun orta hattını arka ucundan ön ucuna kadar kesin. Epitel dokularını merkezden çevirin ve epidermal kenarı cam sürgünün yüzeyine tutturun.

Dorsal longitudinal trakeal gövdeleri ve kalan bağırsakları çıkarmak için havayı aspire etmek veya üflemek için yaklaşık 300 mikrometre uç açıklığına sahip tüp bağlantılı bir iğne kullanın. Embriyoları bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 5 dakika sabitlemek için% 4 PFA ve PBS kullanın. Sonra PBS ile üç kez yıkayın.

Embriyoları orbital çalkalayıcı üzerinde bir saat boyunca siyanin, 3 boya ve 200 mikrolitre PBS ile konjuge edilmiş 1 mikrolitre anti-yaban turpu peroksidaz antikoru ile boyayın. Ve yıkamaları PBS'de tekrarlayın. Enjeksiyon mikropipetini doldurmak için kılcal tutucuya yerleştirin. Ardından, boya slaytını sahneye yerleştirin ve slaytın üzerine yerleştirmek için mikromanipülatörü kullanın.

Ardından, mikropipeti boyanın üzerine yerleştirmek için aşamayı ayarlayın. Enjeksiyon basıncını 200 ila 500 hektopaskal arasında, enjeksiyon süresini 0,1 ila 0,5 saniye arasında ve dengeleme basıncını 5 dakika boyunca 0'a ayarlayarak boyayı ve mikropipeti toplayın. Boya toplandıktan sonra, boya lamını çıkarın ve numuneyi mikroskop tablasına yerleştirin.

Ardından dengeleme basıncını 30 ila 60 hektopaskal aralığına yükseltin ve mikropipeti numuneye indirin. Embriyoyu bulmak ve mikropipeti embriyo ile hizalamak için 10 kez objektif lensi kullanın. Objektif lensi 40 kez suya daldırılan bir lensle değiştirin ve lensi PBS'ye daldırın.

Anti-HRP Cy3 ile işaretlenmiş nöronal morfolojiyi kontrol etmek ve enjeksiyon bölgesini belirlemek için floresan mikroskobu kullanın. Embriyo odakta olduğunda, ilgilenilen aksonun ucuyla hafifçe temas etmek için mikropipetin konumunu değiştirin. Daha sonra boya damlacığını görmek için enjeksiyon sırasında parlak alan mikroskobu kullanın. Boyayı, DiD veya DiO ile ACC veya RP3'ün nöromüsküler kavşağındaki sağ abdominal hemisegmente bırakın.

Boyayı serbest bırakmak ve mikropipeti çıkarmak için el kumandasını kullanın. Ardından bir sonraki enjeksiyon bölgesine geçin. Görüntülemeden önce numuneyi oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcı üzerinde 1 saat inkübe edin. İnce forseps kullanarak bantları cam slayttan çıkarın.

Numuneyi monte etmek için, dört köşesinde az miktarda vakumlu gres bulunan bir lamel hazırlayın. Hava kabarcıklarını önlemek için dikkatli bir şekilde numunenin üzerine yerleştirin. Objektif merceği ile slayt arasındaki çalışma mesafesine izin vermek için numuneden boşluğu ayarlamak için lamel aşağı doğru itin.

Görev silme işlemleriyle fazla PBS'yi kaldırın. Lamelin kenarlarını oje ile tamamen kapatın. Konfokal mikroskop ile 10 kat ve 100 kat büyütme ile görüntü alın ve görüntüleri ImageJ yazılımı ile işleyin.