Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu Kullanılarak Bir Doku Bölümündeki Amiloid Yapılarının Analiz Edilmesi

Anormal protein birikintilerini temsil eden amiloid agregatları olan bir doku kesiti alın.

Doku, spesifik olarak amiloid fibrillerin beta-tabaka yapılarına bağlanan floresan boya heptamer-formil tiyofen asetik asit veya hFTAA ile boyanır.

Boya moleküllerinin floresan ömrünü ölçen bir floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu ünitesi ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanarak slaydı görüntüleyin.

Boya moleküllerinin etkili bir şekilde uyarılması için mikroskop ayarlarını optimize edin.

Lazer ışığı dokuyu aydınlattığında, hFTAA uyarılır ve floresan verir.

Kompakt yapılarda daha güçlü boya bağlanması daha uzun kullanım ömrüne neden olurken, daha az kompakt yapılarda daha zayıf boya bağlanması daha kısa kullanım ömrüne yol açar.

Daha sonra, yazılım toplamın renk kodlu bir görüntüsünü oluşturur.

Kırmızı ve sarı gibi renkler, daha az kompakt, kararsız amiloid yapıları yansıtan daha kısa floresan ömürlerini gösteren çevrede görünür.

Çekirdekteki mavi ve yeşil gibi renkler daha uzun floresan ömürlerini temsil ederken, daha kompakt ve kararlı amiloid yapıları yansıtır.

Boyama gününde, bölümleri her seferinde 10 dakika boyunca ardışık %99 etanol, %70 etanol, dH_2O ve PBS banyolarına daldırın, ardından doku bölümlerinin ortam koşullarında kurumasını bekleyin. Doku kururken, stoğu PBS'de 1 ila 10.000 oranında seyrelterek çalışan bir HFTAA çözeltisi hazırlayın. Doku kuruduğunda, üzerini örtmek için her doku bölümüne HFTAA çalışma solüsyonunun damlacıklarını ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Boyama solüsyonunu 500 mikrolitre PBS ile durulayın ve ardından slaytı 10 dakika boyunca PBS banyosuna daldırın. Bölümün ortam koşullarında kurumasına izin verdikten sonra, floresan montaj ortamı kullanarak monte edin. Montaj ortamının gece boyunca oturmasına izin verin.

Amiloid tespiti, montajdan hemen sonra veya hatta montaj olmadan gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, deneyin amacı yüksek kaliteli spektral bilgi toplamaksa, gece boyunca inkübasyon tercih edilir.

Mikroskobu FLIM moduna geçirin, iğne deliğini 20'ye, uyarma dalga boyunu 490 nanometreye ve lazer yoğunluğunu %0,5'e ayarlayın. 40 megahertz'de darbeli lazerler kullanın. FLIM yazılımında, 550 nanometreden fazla foton saymayı ayarlayın. Görüntü Parametreleri penceresinde, maksimum sayı yaklaşık 4.000 foton sayımı olana kadar foton sayımını takip edin. Dosyayı kaydedin ve SPC görüntüsü olarak dışa aktarın.