Fare Beyin Bölümlerinde Hipokampal Nöronal Aktivasyonun Görüntülenmesi

Nöronlar açısından zengin dorsal hipokampusu açığa çıkaran fare beyin bölümleriyle başlayın.

Nöronal peroksidaz aktivitesini söndürmek için hidrojen peroksit ekleyin, ardından yıkayın.

Bir geçirgenleştirme arabelleği ile işlem yapın, ardından spesifik olmayan bağlamayı engellemek için bir engelleme arabelleği uygulayın.

Primer antikorları ekleyin ve çalkalama ile inkübe edin. Bu antikorlar nöronal aktivasyon işaretleyici proteinlerine bağlanır.

Primer antikorları bağlamak için biotin ile konjuge ikincil antikorları yıkayın ve uygulayın.

Durulayın ve konjugatlar üzerindeki biotine bağlanan bir avidin-biotin-peroksidaz kompleksi ekleyin.

Tekrar yıkayın, ardından kahverengi bir çökelti oluşturmak için peroksidaz tarafından oksitlenen kromojenik bir substrat ekleyin. PBS ile reaksiyonu durdurun.

Bölümleri jelatin kaplı bir slayta aktarın ve artan konsantrasyonlarda etanol kullanarak kurutun. Ardından, ksilen içindeki bölümleri temizleyin ve monte edin.

Slaytı parlak alan mikroskobunun altına yerleştirin.

Işık aydınlatması altında, lekelenmemiş bölgeler ışığı iletir ve parlak görünürken, lekeli nöronlar ışığı emer ve yansıtır ve daha koyu görünür.

Belirgin koyu alan, hipokampus içindeki nöronal aktivasyonu gösterir.

Her fare için üç ila beş dorsal hipokampal bölümü, her kuyucuk için 500 mikrolitre 0.1 molar PBS içeren 24 çok oyuklu bir plakanın kuyucuklarına aktarın. Her bir kuyucukta bulunan bölümleri 500 mikrolitre 0.1 molar PBS ile yıkayın. Aksi belirtilmedikçe, tüm yıkama ve inkübasyonları oda sıcaklığında hafif çalkalama ile gerçekleştirin. Bir davlumbaz altında, endojen peroksidaz aktivitesini söndürmek için bölümleri 0.1 molar PBS'de% 40 metanol,% 1 hidrojen peroksit içinde 20 dakika inkübe edin.

0.1 molar PBS'de üç yıkamadan sonra, bölümleri 500 mikrolitre% 0.2 Triton X-100 içinde beş dakika inkübe ederek geçirgen hale getirin. Bölümler inkübe edilirken, tüm deney için yeterli engelleme tamponu hazırlayın. Ardından, geçirgenleştirme çözeltisini çıkarın ve her bir oyuğa 100 mikrolitre blokaj tamponu ekleyin. Bölümleri bir saat inkübe edin.

Daha sonra, bloke edici tamponu çıkarın ve bölümleri, bloke edici tamponda 1 ila 500 oranında seyreltilmiş fosforile hücre dışı düzenlenmiş kinaz birincil antikoru ile kaplayın. Bölümleri gece boyunca 4 santigrat derecede hafif çalkalama ile inkübe edin. Ertesi gün, bölümleri her biri 5 dakika boyunca 0.1 molar PBS'de üç kez yıkadıktan sonra, bölümleri oda sıcaklığında bir saat boyunca 1 ila 250 bloke edici tampon ile seyreltilmiş bir biyotin konjuge ikincil antikor ile inkübe edin.

Kuluçka sırasında, avidin ve biyotin kompleksinin oluşması için yeterli zaman tanımak için ABC reaktifini kullanımdan en az 30 dakika önce hazırlayın. Bölümleri 0.1 molar PBS ile üç kez daha yıkadıktan sonra, ABC reaktifini ekleyin ve numune ile 45 dakika inkübe edilmesine izin verin. PBS'deki bir sonraki üç yıkama seti sırasında, çeker ocaktaki dab çalışma solüsyonunu üreticinin spesifikasyonlarına göre hazırlayın. Plakadaki dab çalışma solüsyonunu aliquot.

Ardından, bölümleri DAB çalışma solüsyonunu içeren kuyucuklara aktarın ve bölümlerin çözeltiye maksimum maruz kalmasını sağlamak için plakayı yavaşça döndürün. DAB reaksiyonunu yaklaşık iki ila beş dakika içinde yeterli sinyal gelişene kadar mikroskopta izleyin. Dokuyu 0.1 molar PBS'de yıkayarak reaksiyonu istenen renk yoğunluğunda durdurun. PBS'de üç yıkamadan sonra, bölümleri jelatin kaplı slaytlara monte edin ve oda sıcaklığında en az üç ila dört saat kurutun.

Hava kuruduktan sonra, sürgüleri çeker ocakta aktarın ve bölümleri, her biri iki dakika boyunca kademeli etanol çözeltilerine sırayla yerleştirerek kurutun. Ardından, slaytları beş dakika boyunca %100 ksilen içinde temizleyin. Kızakları montaj ortamı kullanarak örtün ve kuruması için gece boyunca çeker ocakta bırakın.

Slaytları 20x objektif lensli bir kamera ile donatılmış parlak bir alan mikroskobuna aktarın. Dorsal hipokampusu kaplayan 200x büyütmede her bölümden birden fazla parlak alan görüntüsü elde edin. Her hayvandan üç ila beş bölüm görüntüleyin.