Organotipik Bir Fare Hipokampal Diliminde FRET Tabanlı Sensörler Kullanılarak Hücre İçi ATP Dinamiğinin Görüntülenmesi

Organotipik bir fare hipokampal dilimini deney odasında sabitleyin.

Dilim, verici ve alıcı floresan proteinleri olan bir ATP sensörünü ifade eden dönüştürülmüş nöronlar ve astrositler içerir.

Odayı bir floresan mikroskobu aşamasına yerleştirin ve oksijenli ACSF ile perfüze edin.

Dilimin arabelleğe alınan koşullara uyum sağlamasına izin verin.

İletim ışığını kullanarak dilimi odaklayın ve ilgi alanını belirleyin.

Floresan moduna geçin ve floresan emisyonunu başlatmak için donör floresan proteinini uyarın.

ATP bağlandıktan sonra, sensör konformasyonel değişikliklere uğrar ve donörden alıcıya floresan tabanlı enerji transferini sağlar ve bu da daha uzun bir dalga boyunda floresan yayar.

Verici ve alıcı emisyonlarını izole etmek ve ayırmak için dikroik bir ayna ve bant geçiren filtreler kullanın.

Arka plan çıkarma işlemi için floresan olmayan bir bölge seçin. Ardından, hedef hücreleri tanımlayın ve zaman içindeki floresanlarını kaydedin.

Hücre içi ATP seviyelerini gerçek zamanlı olarak izlemek için FRET oranını hesaplayın.

Deneysel ACSF'yi hazırlayın ve en az 30 dakika boyunca karbojen kaynağına bağlı yerleştirilmiş bir borudan %95 oksijen ve %5 karbondioksit ile köpürterek 7.4'lük bir pH elde