Organotipik Bir Fare Hipokampal Diliminde FRET Tabanlı Sensörler Kullanılarak Hücre İçi ATP Dinamiğinin Görüntülenmesi
JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 3:40 dk • April 28th, 2025
Organotipik bir fare hipokampal dilimini deney odasında sabitleyin.
Dilim, verici ve alıcı floresan proteinleri olan bir ATP sensörünü ifade eden dönüştürülmüş nöronlar ve astrositler içerir.
Odayı bir floresan mikroskobu aşamasına yerleştirin ve oksijenli ACSF ile perfüze edin.
Dilimin arabelleğe alınan koşullara uyum sağlamasına izin verin.
İletim ışığını kullanarak dilimi odaklayın ve ilgi alanını belirleyin.
Floresan moduna geçin ve floresan emisyonunu başlatmak için donör floresan proteinini uyarın.
ATP bağlandıktan sonra, sensör konformasyonel değişikliklere uğrar ve donörden alıcıya floresan tabanlı enerji transferini sağlar ve bu da daha uzun bir dalga boyunda floresan yayar.
Verici ve alıcı emisyonlarını izole etmek ve ayırmak için dikroik bir ayna ve bant geçiren filtreler kullanın.
Arka plan çıkarma işlemi için floresan olmayan bir bölge seçin. Ardından, hedef hücreleri tanımlayın ve zaman içindeki floresanlarını kaydedin.
Hücre içi ATP seviyelerini gerçek zamanlı olarak izlemek için FRET oranını hesaplayın.
Deneysel ACSF'yi hazırlayın ve en az 30 dakika boyunca karbojen kaynağına bağlı yerleştirilmiş bir borudan %95 oksijen ve %5 karbondioksit ile köpürterek 7.4'lük bir pH elde edin. Tüm deney boyunca tuzlu suyu kabarcıklı tutun. Ardından, monokromatörün floresan ışık kaynağını açın.
Organotipik dilim kültürünü deney odasına aktarın. Organotipik dilim kültürünün üzerine, çerçeve aşağı bakacak şekilde, kültüre dokunmayacak ve iplikler yukarıda, zara değecek şekilde bir ızgara yerleştirin. Odayı mikroskop tablasına yerleştirin ve perfüzyon sistemine bağlayın.
Peristaltik pompayı dakikada 1,5 ila 2,5 mililitre akış hızında açın. Perfüzyon sisteminde sızıntı olmadığından emin olun. İletim ışığını kullanarak, kültürlenmiş dilimi odak noktasına getirin ve deneylerin yapılacağı alanı belirleyin.
Görüntüleme deneylerine başlamadan önce, dilimlerin tuzlu su koşullarına uyum sağlaması için en az 15 dakika bekleyin. Ardından kamerayı ve görüntüleme yazılımını açın. Donör floresan proteinini 435 nanometrede uyarın. Pozlama süresini 40 ila 90 milisaniye arasında bir değere ayarlayın.
Ardından, dikroik aynayı ve filtreleri ışın ayırıcı ünitesine yerleştirin. Floresan emisyonunu bir emisyon görüntü ayırıcı ile 500 nanometrede bölün ve verici ve alıcı floresansını daha fazla izole etmek için 482 artı veya eksi 16 ve 542 artı veya eksi 13,5 nanometrede bant geçiren filtreler kullanın.
Arka plan çıkarma için görünüşte hücresel floresanstan yoksun bir ilgi alanı seçin. ROI'ler oluşturmak için ekrandaki görüntüdeki etiketli dokunun tek tek yapılarını daire içine alın. Genel kayıt süresinde görüntü alma sıklığını ayarlayın. 30 dakikadan uzun deneyler için, fototoksisiteyi önlemek için 0,2 ila 0,5 Hertz'lik bir edinme frekansı önerilir. Ardından, kaydı başlatın.
Genel Bakış
Bu makale, organotipik fare hipokampal dilimlerinde floresan rezonans enerji transferi (FRET) kullanarak hücre içi ATP seviyelerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesine yönelik bir yöntemi açıklamaktadır. Bu yaklaşım, donör ve akseptör floresan proteinlere sahip bir ATP sensörü eksprese eden transdükte nöronların ve astrositlerin kullanımını içermektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Floresan Görüntüleme
Arka Plan
- Hücre içi ATP seviyeleri hücresel fonksiyonlar için kritiktir.
- FRET, canlı hücrelerdeki moleküler etkileşimleri incelemek için güçlü bir tekniktir.
- Organotipik kesit kültürleri, beyin dokusunun mimarisini ve hücresel bileşimini korur.
- Floresan proteinler, biyolojik süreçlerin gerçek zamanlı görüntülenmesine olanak tanır.
Çalışmanın Amacı
- Canlı beyin kesitlerinde ATP seviyelerinin gerçek zamanlı izlenmesi için bir yöntem geliştirmek.
- Hücresel enerji durumlarını değerlendirmek için FRET yöntemini kullanmak.
- Nöronal ve glial hücrelerde ATP dinamikleri konusundaki anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Organotipik fare hipokampal dilimlerinin hazırlanması.
- Nöronların ve astrositlerin ATP sensörleri ile transduksiyonu.
- FRET sinyallerini izlemek için floresan mikroskobun kullanımı.
- Hassas ölçümler için arka plan çıkarma ve ilgi alanı (ROI) seçimi.
Ana Sonuçlar
- Kesitlerin deneysel koşullara başarılı şekilde adaptasyonu.
- ATP seviyelerinin FRET oranları aracılığıyla gerçek zamanlı izlenmesi.
- ATP dalgalanmalarına karşı hücresel yanıtların belirlenmesi.
- Fototoksisiteyi minimize etmek için optimal görüntüleme parametrelerinin oluşturulması.
Sonuçlar
- Bu yöntem, canlı beyin dokusundaki ATP dinamiklerini incelemek için güvenilir bir yaklaşım sunar.
- FRET tabanlı görüntüleme, hücresel enerji metabolizmasına dair içgörüler sağlayabilir.
- Bu teknik, nöronal fonksiyonları araştırmak amacıyla çeşitli deneysel koşullara uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Alaka
Canlı beyin dokusunda hücre içi ATP dinamiklerinin izlenmesi, hücresel enerji durumlarını fonksiyonel sonuçlarla ilişkilendirerek nöroterapötik hedeflerin mekanistik olarak risklerinin azaltılmasını sağlar. FRET tabanlı bu yaklaşım, fizyolojik koşullar altında nöronal ve glial metabolizmaya ilişkin kantitatif ve gerçek zamanlı okumalar sunarak erken keşif aşamasındaki hedef doğrulamasını destekler. Yöntem, doku mimarisini korurken farmakolojik veya genetik perturbasyonlara yanıt olarak ATP dalgalanmalarının boylamsal değerlendirmesine olanak tanıyarak preklinik modellerdeki öngörüsel güveni artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Hastalıkla ilgili devrelerde ATP dinamiklerini nöronal ve astrositik aktivite ile ilişkilendirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Primer benzeri dokularda genetik olarak kodlanmış sensörler kullanarak fonksiyonel hedef doğrulaması için tekrarlanabilir bir platform sağlar.
- Öngörücü Değer: Fonksiyonel veya toksikolojik fenotiplerden önce gelebilecek erken metabolik değişimleri tespit ederek öncü bileşik tanımlamasını destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Deney Hazırlığı: Farklı deneysel koşullar altında hücre içi ATP seviyelerini belirlemek için standartlaştırılmış FRET oran metrikleri oluşturur.
- Tekrarlanabilirlik: Değişkenliği minimize etmek ve boylamsal görüntülemede sinyal özgünlüğünü sağlamak için arka plan çıkarma ve ROI seçimine olanak tanır.
- Ölçeklenebilirlik: Çok kuyucuklu veya zaman serisi tarama formatları için perfüzyon sistemleri ve otomatik veri toplama ayarlarıyla uyumludur.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: ATP dinamiklerinin in vivo nöronal ağlara ekstrapolasyonunu desteklemek için hipokampal kesit mimarisini korur.
- Mekanistik Risk Azaltma: Hedef etkileşimini hücresel enerji durumlarıyla ilişlendirerek etki mekanizması çalışmalarındaki belirsizliği azaltır.
- Riske Göre Ayarlanmış İlerleme: Fizyolojik olarak ilgili preparatlarda ATP homeostazını bozan bileşikleri belirleyerek devam/dur kararlarını destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, erken hedef doğrulamadan preklinik profillemeye kadar olan keşif sürecine uygundur; burada gerçek zamanlı ATP izlemesi, hem etki mekanizması hem de hücresel toksisite değerlendirmesi hakkında bilgi sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Sensör kaynaklı FRET oranlarını nöron ve astrositlerdeki hücresel enerji akışıyla ilişkilendirerek hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Tanımlanmış eksitasyon/emisyon ayarları ve arka plan çıkarma protokolleri aracılığıyla analiz standardizasyonunu sağlar.
- Analitik: ATP seviyelerinin tedavi grupları veya genetik modeller arasında karşılaştırılmasına olanak tanıyan kantitatif FRET oranı çıktıları üretir.
- Translasyonel Araştırma: In vitro bulguları, sağlam devre düzeyindeki fizyolojiyle ilişkilendirmek için doku düzeyindeki karmaşıklığı korur.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla nöroterapötik program genelinde boylamsal metabolik profilleme için yeniden kullanılabilir bir görüntüleme platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Nöroaktif bileşik taramasındaki mekanistik belirsizliği azaltarak öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Çekirdek görüntüleme tesisi iş akışlarıyla uyumlu, standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir floresan okumaları sağlar.
- Stratejik Değer: Mitokondriyal veya metabolik risklerin erken tespitine olanak tanıyarak sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Hastalıkla ilişkili dokulardaki ATP homeostaz profillerine dayanarak bileşiklerin riske göre ayarlanmış önceliklendirmesini kolaylaştırır.
Uygulama Hususları
- Floresan mikroskopi, FRET görüntüleme ve organotipik dilim kültürü bakımı konusunda uzmanlık gerektirir.
- Donör/akseptör ayrımı için dikroik aynalara, bandgeç filtrelerine ve hassas kameralara sahip konfokal veya geniş alanlı sistemlere bağımlıdır.
- Görüntüleme sırasında ACSF iletimi ve çevresel kontrol için perfüzyon sistemlerini gerektirir.
- Sinyal kalitesi ve fototoksisiteyi dengelemek için uyarım dalga boyunun (435 nm), pozlama süresinin (40–90 ms) ve yakalama frekansının (0,2–0,5 Hz) optimizasyonunu içerir.
- Sensör ekspresyon değişkenliği ve doğru FRET oranı hesaplamalarını sağlamak için arka plan çıkarma ihtiyacı ile sınırlıdır.
Biyofarma SSS
Görselleştirme ve Oligodendrocyte organelleri Adeno ilişkili virüs ve Confocal mikroskobu kullanılarak Organotypic beyin dilimleri içinde canlı görüntüleme
İlgili videolar
0 Görüntüler
Mikroglial süreçleri cazibe ATP veya Serotonin akut beyin dilimleri içinde doğru iki fotonlu görüntüleme
İlgili videolar
0 Görüntüler
İnsan Tümör Hücrelerinde ve Tümör-ksinografted Farelerde Makropinositoz Aracılı ATP İçselleştirme için Floresan Mikroskopi
İlgili videolar
0 Görüntüler
Doğum Sonrası Beyin Nöronal Göç Yüksek Çözünürlüklü Zaman Aşımı Görüntüleme için bir Organotipik Dilim Testi
İlgili videolar
0 Görüntüler
Lazer Tarama Photostimulation tarafından inhibitör nöronal devreler Haritalama
İlgili videolar
0 Görüntüler
Kortikal Ağları Geliştirme Fonksiyonel Kalsiyum Görüntüleme
İlgili videolar
0 Görüntüler
Hipotalamik Fare Beyin Dilimleri GFP etiketli Nöronlar in Görüntüleme Kalsiyum Cevapları
İlgili videolar
0 Görüntüler
Görüntüleme hücre içi Ca 2+ Genetik olarak kodlanmış Kalsiyum Göstergelerini Kullanma Yetişkin fareler ile Striatal Astrositler Sinyalleri
İlgili videolar
0 Görüntüler
Çoklu foton İntrasellüler Sodyum Görüntüleme CA1 piramidal Nöronlar Glutamatın UV-aracılı Odak uncaging ile birlikte
İlgili videolar
0 Görüntüler
Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme
İlgili videolar
0 Görüntüler
Son güncelleme: 29 Ağustos 2026