Fare Retinasının İki Fotonlu İn Vivo Görüntülemesi

Fare retinasının in vivo görüntülemesi için başı bir tutucu üzerinde açılı olarak sabitlenmiş anestezi uygulanmış transgenik bir fare alın.

Retina, florofor etiketli bir proteini ifade eden retinal ganglion hücreleri veya RGC'ler içerir.

Göz kayganlaştırıcı uygulayın ve gözün üzerine bir lamel takın.

Mikroskop altında, RGC'lerdeki floresan proteinleri uyarmak için retinayı eşit şekilde aydınlatın.

Yayılan floresansı kullanarak, odak düzlemi RGC'lerinin ve odak dışı RGC'lerin geniş alan görünümünü elde edin.

Düşük enerjili yakın kızılötesi ışığı RGC katmanına odaklayarak iki fotonlu görüntüleme moduna geçin.

Odak noktasında, iki fotondan gelen birleşik enerji floroforu uyarır, bu da enerjiyi floresan olarak serbest bırakır.

Uyarılma tek bir noktayla sınırlı olduğundan, diğer odak düzlemlerinden gelen floresan en aza indirilir.

RGC katmanının tamamını görüntülemek için z ekseni boyunca birden çok odak düzleminde görüntüler yakalayın.

Farenin her iki gözüne de kayganlaştırıcı göz damlası uygulayın. Kafa tutucunun ana kolunu, bir gözün göz bebeği ışık yolu ile aynı hizaya gelene kadar döndürün ve kompakt filtre tutucusuna 1.5 numaralı bir lamel yerleştirin. Tutucuyu mikroskop aşamasına sabitledikten sonra, lameli korneaya dokunmadan kayganlaştırıcı i-jel ile temas edene kadar indirin. Ve geniş alan uyarma ışığı korneayı tamamen kaplayana kadar sahneyi xy boyutunda ve objektif z konumunda ayarlayın.

Retinadaki floresan hücreler veya yapılar odak haline gelene kadar z konumunu ayarlamaya devam etmek için göz merceğini kullanın ve ilgilenilen hücreleri veya yapıları tek tek çözmek için epifloresan aydınlatıcıyı gerektiği gibi artırın. Retinanın görüntüleme ışık yolu ile hizalanmasına ince ayar yapın. Odak düzlemi değiştirilirken yalnızca odak dışı ışıkta genişleme veya daralma meydana gelene kadar kafa açısını ayarlayın ve xy bozulmalarını en aza indirin.

Ardından epifloresan aydınlatıcıyı kapatın ve aydınlatıcı deklanşörünü kapatın. İki fotonlu görüntüleme için tüm kurumsal lazer güvenlik protokollerini izleyin. Tüm ortam ışığını kapatın ve kapatın ve uyarma ışığı yolunu lazere ve emisyon ışığı yolunu PMT'lere değiştirin.

Görüntü alma yazılımında, kare boyutunu 512 x 512 ve kare ortalamasını 3 olarak ayarlayın. Z adımlamasını yığının en üstünden başlayacak ve aşağı doğru ilerleyerek fotoreseptörlerin iki fotonlu lazer aktivasyonunu en aza indirecek şekilde ayarlayın. PMT'leri açın ve etkinleştirin ve voltajı 680 volta ayarlayın.

Görüntüleme ve emisyon panjurlarını etkinleştirin. %1 lazer gücünden başlayarak hedef dokunun canlı görüntü önizlemesine başlayın ve ilgilenilen hücreleri veya yapıları görselleştirmek için ekran parlaklığını otomatik olarak ayarlayın. Hedef doku loş veya net değilse, yapılar 45 miliwatt'ı aşmadan görünür hale gelene kadar lazer gücü yüzdesini artırın.

İstenen bir görüntüleme alanını merkezlemek için mikroskop aşamasını xy yönünde manevra yapın ve ilgilenilen yapılar odakta olacak şekilde z düzlemine gidin. Kronik hızlandırılmış bir deney için, daha önce elde edilmiş bir görüntüyü, ilgilenilen hücreler için referans olarak kullanmak üzere açın ve mevcut görüntüdeki görüntüleme açısının önceki görüntülerinkine benzer olmasına dikkat edin. Ardından, görüntüleme yığınının z sınırlarını ayarlamak ve görüntüyü elde etmek için ilgilenilen üst ve en alt z düzlemlerine gidin.