JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 4:02 dk • April 28th, 2025
Dairesel bir cam görüntüleme penceresi ve kafatasına yerleştirilmiş bir kafa plakası olan anestezi uygulanmış bir transgenik fare ile başlayın.
Mikroglial veya bağışıklık hücreleri ve nöronlar floresan proteinlerle etiketlenir.
Ardından, fareyi iki fotonlu mikroskop aşamasına sabitleyin.
Ardından, kan damarlarını kırmızıya boyamak için intraperitoneal bir floresan boya enjekte edin.
Cam görüntüleme penceresini temizleyin, tuzlu su damlası uygulayın ve mikroskop objektifini indirin.
Ardından, kan damarlarının görüntüsünü yakalamak için lazer ışığını ayarlayın. Aynı bölgeyi daha sonra bulmak ve görüntülemek için dallanma desenini ve koordinatları kaydedin.
Şimdi, lazeri floresan proteinleri uyararak mikroglia ve nöronların floresan oluşmasına neden olacak şekilde ayarlayın.
Kaydedilen dallanma desenini kullanarak, aynı bölgeyi bulun ve düzenli olarak hücrelerin görüntülerini yakalayın.
Vasküler ağ ve nöronlar sabit kalırken, zaman içindeki mikroglial pozisyon değişiklikleri nöronal aktiviteye yanıt olarak bağışıklık dinamiklerini yansıtır.
Bir diş matkap ucu kullanarak kafatasına yaklaşık 4 milimetre dairesel bir açıklık açın. Delme sırasında, beyni soğutmak için kafatasını düzenli olarak steril tuzlu su ve pamuklu çubuklarla nemlendirin. Kemik kalıntılarını temizleyin ve kafatası kemiğini yumuşatın.
Bitirdiğinizde, kafatasının bu kısmını sivri forsepslerle dikkatlice çıkarın. Kafatası çıkarıldıktan sonra, kraniyotomiye tuzlu su ile nemlendirilmiş küçük bir kapak camını dikkatlice yerleştirin. Steril bir mendil kullanarak fazla tuzlu suyu kurulayın. Sivri uçlu bir aplikatör kullanarak, pencerenin etrafına siyanoakrilat yapıştırıcısı sürün ve beyne ve kafatasına yapışmasına izin verin.
Astar yapıştırıcısını kafatasının geri kalanına uygulayın ve 20 ila 40 saniye boyunca bir kürleme ışığı ile kürleyin. Son yapıştırıcı ile pencerenin etrafında bir kuyu oluşturun ve 20 ila 40 saniye boyunca bir kürleme ışığı ile kürleyin. Astar yapıştırıcı ile kraniotominin kontralateral hemisferindeki kafatasına küçük bir kafa plakası yapıştırın ve ardından son yapıştırıcı ile her ikisini de 20 ila 40 saniye sertleştirin.
Fare uyandıktan sonra, postoperatif analjezi olarak 72 saat boyunca yeterli olacak bir deri altı doz buprenorfin SR enjekte edin. Sağlıklı bir iyileşmeyi kolaylaştırmak için fareye ekstra yumuşak yiyecekler sağlayın. İmplantasyon ameliyatından iki hafta sonra görüntüleme yapılabilir. Kafa plakasını, bir ısıtma plakası ile 35 santigrat derecede tutulması gereken iki foton mikroskobu aşamasına monte etmek için vidaları kullanın.
Fareye deri altına Rhodamine B gibi 100 mikrolitre kan damarı boyası enjekte edin. Kraniyal pencerenin yüzeyini% 70 etanol ile batırılmış bir pamuklu çubukla nazikçe temizleyin. Pencereye birkaç damla su veya tuzlu su damlatın ve objektif merceği solüsyona indirin. Objektif alçalırken lazerin kapalı olduğundan emin olun.
Göz merceğinden bakarken ana kan damarı yer işaretlerini belirtmek için bir rota haritası çizin. İki foton görüntüleme sırasında belirli bölgeleri tanımlamak için bu çizimi kullanın. İki foton görüntüleme kullanarak floresan hücrelerin ve damarların görüntülerini toplayın. Görüntüleme parametreleri için metin el yazmasına bakın. Kesin bölgelerin sonraki görüntüleme için tekrar ziyaret edilebilmesini sağlamak için uygun koordinatlarla dikkatli notlar alın.
Bu ilk görüntüleme oturumunda birkaç görüş alanı toplayın.