JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 2:48 dk. • May 29th, 2025
Transgenik bir fareden alınan frenik sinirlerle hareketsiz hale getirilmiş bir diyafram içeren bir floresan mikroskobu kurulumuyla başlayın.
Diyaframın nöromüsküler kavşağı, bir motor nöron, bir kas lifi ve asetilkolin reseptörleri ve kalsiyum kanalları içeren Schwann hücrelerinden oluşur.
Bu hücreler floresan olarak etiketlenmiş asetilkolin reseptörlerine sahiptir ve hücre içi kalsiyum göstergelerini eksprese eder.
Kuruluma takılan bir görüntü ayırıcı, her iki floresan sinyalinin aynı anda görselleştirilmesini sağlar.
Frenik sinir, elektriksel uyarı vermek için bir emme elektroduna yerleştirilir.
Floresan mikroskobu altında, bir nöromüsküler kavşağı tanımlamak için asetilkolin reseptörlerini görselleştirin.
Maksimum temel floresan ayarlamak için, hücre zarını geçici olarak depolarize etmek için bir potasyum klorür çözeltisi ekleyin. Bu, hücre içi kalsiyum akışını tetikleyerek göstergelerin floresansında bir artışa neden olur.
Floresan sinyalinin aşırı doygunluğunu önlemek için parlaklık ayarlarını yapın.
Repolarizasyondan sonra, hücreye kalsiyum akışını tetiklemek için elektriksel stimülasyonlar uygulayın ve hücre içi floresanstaki değişikliği yüksek kare hızında kaydedin.
20 kat büyütmede, yeşil sarı ışık uyarımı altında floresan etiketli alfa-bungarotoksin nöromüsküler kavşaklarını arayarak kasın merkezindeki uç plaka bandını bulun. Kas, motor nöron veya Schwann hücrelerindeki kalsiyum tepkilerini görüntülemek için mavi ışık uyarımına geçin. Bu örnekte, GCaMP 3 kas hücrelerinde ifade edilir.
İstenirse, çift dalga boylu görüntüleme için bant geçiren filtreler ve dikroik tek kenar filtreli görüntü ayırıcıyı ayarlayın. Potasyum klorüre yanıt olarak gruplama yapmadan, dokuyu ifade eden genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesinin 20 kat büyütmede doygunluk sergilediği seviyenin %110'una ayarlanmış, arama tablosu çubuğundaki parlaklık çubuğuyla deneyler yapın.
Hızlı olayları kaçırmamak için saniyede 20 kare hızında kayıt yapın. Bir emme elektrodu kullanarak bir dizi impuls ileterek 1 ila 45 saniyelik 20 ila 40 hertz sinir stimülasyonu ile uyarın. Ve statik floresan etiketli alfa-bungarotoksin nöromüsküler kavşak sinyali ile birlikte bir hücre alt tipinde dinamik floresan kalsiyum tepkileri toplayın.