Farklı Gelişim Aşamalarında Serebellar Granül Nöronlarının Sinaptogenezinin Görselleştirilmesi

Farelerin erken ve geç doğum sonrası evrelerinden toplanan önceden sabitlenmiş beyin dokusu dilimleri ile başlayın.

Dilim, bir floresan proteini eksprese eden serebellar granül nöronları veya CGN'leri içerir.

Konfokal bir mikroskop kullanarak, tek bir floresan CGN'ye odaklanın.

Nöronun üç boyutlu bir görünümünü oluşturmak için farklı derinliklerde z-yığını görüntüleri yakalayın.

Görüntüleme yazılımı kullanarak, dendritler ve aksonlar dahil olmak üzere nöronların nöritlerini veya uzun projeksiyonlarını izleyin.

Hücre gövdesinden ucuna kadar dendrit uzunluğunu ölçün.

Dendritik pençe oluşumunu, diğer nöronlardan gelen sinyallerin alındığı dendrit uçlarındaki özel yapıları analiz edin.

Ayrıca, nöronun yüzey alanını ve hacmini değerlendirin.

Doğum sonrası erken dönemde, nöronlar pençe oluşumu olmaksızın artan sayıda dendrit gösterir.

Bu arada, doğum sonrası geç dönemde, daha az dendrit vardır, ancak uzunlukları ve pençe sayısı artar.

Böylece, yaşla birlikte, CGN'ler sinaptogeneze uğrar ve sinyal iletimi için diğer hücrelerle bağlantılar oluşturur.

Deneysel yavrunun sagital beyin bölümlerinden tek elektroporasyonlu CGN'lerin morfolojisini incelemek için, konfokal bir mikroskopta yığın başına 0,5 mikrometrede z yığını görüntüleri alın. Kolay görüntü analizine ve 3D yeniden yapılandırmaya izin vermek için görüntü penceresi başına bir hücre görüntüleyin. Basit nörit izleyici kullanarak nörit uzunluğunu ve dendritik pençe oluşumunu kör bir şekilde analiz edin.

Elektroporasyonlu CGN'lerin tek kanallı yığın görüntülerini Fiji içine yükleyin ve Eklentiler, Segmentasyon ve Basit Neurite Tracer'a tıklayın. Açılır menüden Yeni 3D Görüntüleyici Oluştur'u seçin. Hücre Soma'ya bağlanan bir dendritin tabanına kaydırın ve bağlantı noktasına tıklayarak bir banyo başlatın. Hücre doldurma sinyalinin en parlak olduğu bölümlere tıklayarak ve izi korumak için Y tuşuna basarak yolu manuel olarak izleyin.

Dendritin sonuna kadar takip edin ve F tuşuna basarak yolu onaylayın. Alternatif olarak, pençenin tabanına kadar takip edin. Daha sonra, pençeyi yapının tabanından en uzun nöritin sonuna kadar takip edin. Windows'ta Control tuşunu veya Mac OS'ta Alt tuşunu basılı tutup yolu tıklatarak ikincil ve üçüncül dalları izleyin. F tuşuna basarak yolu onaylayın. İzler için ölçümlerin ayrı bir pencerede göründüğünü gözlemleyin. Her pençe için toplam uzunluğu elde etmek için pençe dallarının tüm boyutlarını toplayın.