Sıçan Beyin Dokusunda Yeni Üretilen Nöronların Optik Fraksiyonatör Tekniği Kullanılarak Ölçülmesi

Bromodeoksiuridin veya timidinin bir nükleosit analoğu olan BrdU enjekte edilen bir sıçandan hipokampal beyin dilimleri alın.

BrdU, hücre bölünmesi sırasında DNA'ya entegre olur ve nörojenez için bir bölge olan dentat girus içinde yeni üretilen nöronları etiketler.

Endojen peroksidaz enzimlerini inaktive etmek için oksitleyici bir ajan ile inkübe edin.

DNA'yı denatüre etmek ve BrdU'yu açığa çıkarmak için asitle muamele edin, ardından asidi nötralize edin.

Hücresel zarları geçirgen hale getirmek için bir deterjan ve spesifik olmayan bağlanma bölgelerini maskelemek için bir engelleme çözeltisi ile inkübe edin.

BrdU'yu hedefleyen primer antikorlarla inkübe edin, ardından primer antikorlara özgü peroksidaz etiketli ikincil antikorlar izleyin.

Peroksidazın substratı renkli bir kalıntıya dönüştürmesine izin veren bir kromojenik substrat ve bir oksitleyici ajan ekleyin.

Dokuyu monte edin ve nükleik asit bağlayıcı bir boya ile lekeleyin.

Dokuyu kurutun, ardından şeffaflığı artırmak için tedavi edin.

Mikroskop altında, dentat girusu tanımlayın.

Optik fraksiyonatör tekniğini kullanarak, BrdU etiketli nöronları ölçmek için doku kalınlığı boyunca birden fazla düzlemi analiz edin.

Başlamaya hazır olduğunuzda, immün boyama, bölümlerin oda sıcaklığına gelmesine izin verin. Ardından, her beşinci bölümü bir dizi hipokampal bölümden PBS ile doldurulmuş Petri kaplarına yerleştirilmiş 25 oyuklu boyama ağlarına aktarmak için bir boya fırçası kullanın. Boyama için hipokampus başına 8 ila 12 bölüm olmalıdır. Bölümleri içeren boyama ağlarını PBS içeren uygun cam tabaklara aktarın ve bölümleri PBS'de 10 dakika boyunca iki kez yıkayın.

Ardından, 20 dakika% 3 hidrojen peroksit içinde inkübe edin. Yıkadıktan sonra, bölümleri üç hidroklorik asit çözeltisinden geçirin. Daha sonra, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 0.1 molar sodyum tetraborat içinde nötralize edin.

Yıkama tamponu değişikliklerinde 10 dakikalık üç inkübasyondan sonra, bölümleri oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edici çözeltiye aktarın. Daha sonra, bölümleri fare anti-BrdU'da inkübe edin, 4 santigrat derecede 48 saat boyunca bloke edici çözelti içinde 1 ila 100 oranında seyreltin.

Birincil antikor inkübasyonundan sonra, her biri yıkama tamponunda 10 dakika boyunca üç kez yıkayın, daha sonra yaban turpu peroksidaz içinde 48 saat inkübe edin, yıkama tamponunda 1 ila 10 oranında seyreltin. 48 saat sonra, bölümleri 10 dakika boyunca PBS'ye aktarın ve toplam beş yıkama için tekrarlayın. Yıkadıktan sonra, bölümleri yedi dakika boyunca DAB çözeltisine aktarın. Daha sonra 10 dakika boyunca% 0.02 hidrojen peroksit içeren DAB çözeltisine aktarın.

Bir dizi yıkamadan sonra, bölümleri mikroskop slaytlarına sayısal sırayla monte edin. Yaklaşık 30 dakika kurumaya bırakın. Ardından, numuneleri bir sürgülü rafa yerleştirerek havayla kurutun. Daha sonra, numuneleri damıtılmış su içeren bir slayt boyama kabında 10 dakika boyunca yeniden sulandırın.

Ardından, slaytları 15 dakika boyunca damıtılmış suda %0,02 kristal viyole olarak aktarın. Kristal viyole lekesini tekrarladıktan sonra, bölümleri bir etanol serisinden yeniden sulandırın. Ardından, ksilen içindeki bölümleri her seferinde 15 dakika boyunca iki kez temizleyin. Son olarak, hızlı kuruyan montaj ortamı ekleyin ve slaytları lamel yapın.

24 saat sonra, slaytlar mikroskopi için kullanılabilir. Slaytları önce mikroskobun motorlu aşamasına yerleştirerek ve ardından stereoloji yazılımını açarak dokunun kalınlığını kontrol ederek başlayın. 100x yağa daldırma hedefine geçmeden önce düşük büyütme hedefi kullanarak ilgilenilen alanı tanımlayın.

Ardından, muhasebe çerçevesinde belirli bir noktayı, örneğin bir köşeye bitişik bir alanı seçin ve bölümün bazı özellikleri odakta görünene kadar odak düzlemi boyunca hareket ederek bölümün üst kısmını bulun. Bu z konumunu 0 olarak kaydedin. Ardından, dokunun son z seviyesi odakta olana kadar odak düzlemini doku boyunca aşağı doğru hareket ettirin, ardından bu konumu işaretleyin. Lokal doku kalınlığı 0'dan bu uç noktaya kadar tanımlanır ve z ekseninde okunabilir.

Doku kalınlığını kaydedin. Doku kalınlığı, ilgilenilen bölge içinde birkaç yerde ölçülür. Disektör ve koruma bölgelerinin yüksekliği, saymanın boyutu, çerçeve adım uzunluğu ve son büyütme bir pilot çalışmada belirlenir. Şimdi, BrdU-pozitif nöronları, genellikle 2.000 ila 3.000x büyütme oranında, 60x yağ veya 100x yağ objektifi ve yüksek bir sayısal açıklık kullanarak saymaya başlayabilirsiniz.

Her sayma çerçevesinde BrdU-pozitif nöronları tanımlayın, ancak kırmızı dışlama çizgisine dokunanları saymayın. Yeşil inklüzyon çizgisine dokunan BrdU-pozitif nöronları ve sayma çerçevesinin sınırları içinde kalanları sayın. BrdU-pozitif nöronları yalnızca, ilgilenilen özellik disektör yüksekliği içinde açıkça tanındığında sayın. Burada gösterilen yarı görünür nöronlar sayılmaz.