JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 2:39 dk • May 29th, 2025
Floresan etiketli internöromast hücreleri veya INMC'ler içeren, bir lamel üzerine monte edilmiş ve konfokal mikroskop altına yerleştirilmiş bir zebra balığı larvası ile başlayın.
INMC'ler, daha önce lazer ablasyona tabi tutulmuş, rejeneratif yeteneğe sahip progenitör hücrelerdir.
İlk olarak, hasarlı alanı floresan modunda gözlemleyin. Floresan olmaması, başarılı lazer ablasyonunu doğrular.
Ardından, hücrenin düzensiz çekirdeklerle granüler ve şişmiş göründüğü hasarlı alanı incelemek için iletilen ışık görüntüleme modunu kullanın ve hücre ölümünü doğrulayın.
Makrofajların bölgeye alınması, yaralanmaya aktif bir hücresel yanıtı gösterir.
Şimdi, floresan moduna geri dönün ve kurtarmayı izlemek için düzenli aralıklarla hızlandırılmış görüntüler yakalayın.
Kurtarma aşaması sırasında, INMC'ler projeksiyonları boşluğa uzatarak kapanmayı kolaylaştırır ve hücresel onarımı destekler.
Bu zaman serisi görüntülerini analiz için kaydedin. Ablasyonlu alanda farklı floresansın yeniden ortaya çıkması, başarılı hücre iyileşmesini doğrular.
Ablasyon sonrası hücre gövdelerinin görüntülenmesi için, Kanallar menüsü altında, ablasyon lazerini etkisiz hale getirmek için DAPI izinin işaretini kaldırın ve edinme modu menüsünü açın. Yakınlaştır'a tıklayın ve yakınlaştırmayı 0,7'ye düşürün.
Hücre ablasyonunun başarısını değerlendirmek için görüş alanını hızlı bir şekilde tarayın. Preablasyon görüntüleme için olanlarla aynı ayarları kullanarak, ablasyon sonrası bir görüntü yakalayın ve kaydedin. Hücresel hasarı daha fazla doğrulamak için iletilen ışık fotoçoğaltıcı tüp kanal görüntüsünü inceleyin. Hasarlı hücreler tanecikli bir görünüm gösterecek ve çekirdekler sıklıkla şişecek veya düzensiz görünecektir.
Ablasyon sonrası hücre gövdesi geri kazanımını değerlendirmek için, zaman atlamalı görüntü yakalama için hem aşama konumunu hem de zaman seçeneklerini etkinleştirin ve zaman parametrelerini uygun deneysel zaman noktasına ve 15 dakikalık aralıklara ayarlayın. Ardından, görüntüleri almak için denemeyi başlatın ve tamamlandığında elde edilen dosyayı kaydedin.