Bir Fare Kolonik Myenterik Pleksusunda Enterik Nöron ve Glia Aktivitelerinin Kalsiyum Görüntülemesi

Enterik nöron ve glial hücre ağlarından oluşan ganglionlu pleksusları barındıran hareketsiz fare kolonik myenterik pleksus dokusu içeren bir görüntüleme odası alın.

Bu hücreler, kalsiyum bağlanması üzerine floresan veren bir kalsiyum indikatörü ile etiketlenir.

Ardından, odayı bir floresan mikroskobu aşamasına yerleştirin. Görüntüleme sırasında kas kasılmalarını bastırmak için odayı önceden ısıtılmış inhibitörler içeren bir tamponla perfüze edin.

Bir mikroskop kullanarak, düzgün floresan sergileyen sağlıklı ganglionik bölgeleri tanımlayın.

Temel aktiviteyi ölçmek için hücre içi kalsiyum seviyeleri için bir referans sağlayan floresan görüntüler elde edin.

Hücre içi kalsiyum akışını ve floresan yoğunluğunda bir artışı tetikleyen nöronal reseptörleri aktive etmek için dokuyu bir reseptör agonisti ile perfüze edin.

Nöronal aktivasyon dolaylı olarak çevredeki glial hücreleri uyararak kalsiyum akışına ve ardından floresanda bir artışa yol açar.

Floresan yoğunluğundaki değişiklikleri ölçmek için hem nöronlarda hem de glial hücrelerde temel seviyelere göre kalsiyum dinamiklerini ve sinyal aktivitesini gösteren hızlandırılmış floresan görüntüler yakalayın.

İnkübasyon sırasında, protokolün yazılı bölümündeki talimatlara göre modifiye edilmiş bir Kreb tamponu yapın ve kalsiyum 2 ve tüm montaj diseksiyonlarında görüntüleme sırasında kas kasılmalarını inhibe etmek için 3 mikromolar nikardipin ve 1 mikromolar skopolamin ekleyin. Kayıt odasını floresan mikroskobu altına yerleştirin ve birden fazla ısıtılmış şırınga rezervuarına sahip bir yerçekimi akışı perfüzyon sistemi kullanarak, 37 santigrat derece Kreb'in tamponunda dakikada 2 ila 3 mililitre sürekli bir perfüzyon hızı oluşturun. Hem tavada hem de bir vakum kapanına bağlı emiş hattında hava kabarcığı oluşumunu önlediğinizden emin olun. Parlak alan aydınlatması altında istenen pleksusu odağa getirin. Dokuyu aşırı maruz bırakmaktan kaçının, bu da foto ağartmaya neden olabilir.

Ganglionlar içindeki florofor yükünü inceleyin ve görüntüleme için sağlıklı gangliyonları seçin. Sağlıksız hasarlı ganglionlar otofloresan veya punktat morfoloji sergileyecektir ve görüntüleme için kullanılmamalıdır. Bir ganglion seçildikten sonra, ışık yolunu kameraya yönlendirin ve görüntü elde etme yazılımı ile canlı bir görüntü elde edin. Ganglionun odakta olduğundan emin olun ve görüntü elde etme oranını ve pozlama sürelerini ayarlayın.

Görüntü alma oranları ve süreleri, araştırmacıların kaydetmek istediği olaylara bağlı olarak değişecektir. Çoğu deney için, görüntüler geleneksel olarak glial hücreler için 0,5 ila 1 hertz'de ve nöronlar için 2 ila 10 Hertz'de elde edilir, çünkü glial kalsiyum geçici nöronları kalsiyum geçici nöronları kadar hızlı değildir.

Kaydı başlatın ve 30 saniye boyunca deneysel uyaranların yokluğunda seçilen ganglionun temel fizyolojik aktivitesini oluşturun. Daha sonra, ilacınız için optimize edilmiş bir protokole göre dakikada 2 ila 3 mililitre oranında yerçekimi akış perfüzyon sistemini kullanarak, reseptör agonistleri ve antagonistler gibi önceden ısıtılmış ilaçları uygulayın. Kaydı durdurun ve deneyin zaman atlamalı filmini izleyin.

Uygun görüntü analizi yazılımını kullanarak ilgi alanlarını veya yatırım getirilerini dikkatlice seçin.

Son olarak, ilgilenilen bölgelerin floresan yoğunluğunu normalleştirmek ve başlangıçtaki temel değeriyle karşılaştırmak için uygun görüntüleme yazılımı kullanın. Normalleştirilmiş floresanstaki değişiklikler kalsiyumdaki değişikliklerle doğru orantılıdır.