Sabit Bir Fare Beyin Diliminde Floresan Boya İyontoforezi Kullanılarak Astrosit Morfolojisinin Görselleştirilmesi

Kimyasal olarak sabitlenmiş bir fare beyni dilimini tampon içeren cam tabanlı bir tabağa yerleştirin ve bir ağ ile sabitleyin.

Anyonik, hidrofilik floresan boya ile doldurulmuş bir elektrodu bir voltaj kaynağına bağlayın.

Elektrik devresini tamamlamak için tampona bir toprak elektrodu yerleştirin.

Parlak alan aydınlatmasını kullanarak, boya dolgulu elektrodu dilime doğru ilerletin.

Bir astrositin yerini belirlemek için kızılötesi diferansiyel girişim kontrast görüntülemeye geçin.

Sitoplazmaya erişmek için astrosit soma'yı elektrotla delin.

Boyayı iyontoforez yoluyla sitoplazmaya sürmek için bir elektrik akımı uygulayın.

Boya hareketini izlemek için konfokal mikroskoba geçin.

Hidrofobik zarı geçemeyen hidrofilik boya, soma ve dalları doldurmak için sitoplazma içinde yayılır.

Hücre dolduktan sonra akımı durdurun ve elektrodu geri çekin.

Astrosit zarının yeniden kapanmasına izin verin.

Çeşitli Z-düzlemlerinde görüntüler elde edin ve astrosit morfolojisini görselleştirmek için bunları yeniden oluşturun.

Boya enjeksiyon testi için, oda sıcaklığında 0.1 molar PBS ile doldurulmuş cam tabanlı bir tabağa hafifçe sabitlenmiş bir beyin dilimini nazikçe yerleştirin. Ve dilimi naylon ipli bir platin arp ile yerinde tutun.

Elektrodu bir voltaj kaynağına bağlayın ve toprak elektrodunu beyin dilimini içeren banyoya yerleştirin. Konfokal mikroskobun objektifini ilgilenilen beyin bölgesine taşıyın.

Ve 10x suya daldırma lensini kullanarak elektrodu çözeltiye indirin ve elektrodu görüş alanının merkezine hareket ettirin. Ardından, parlak alan altında, elektrodu yavaşça dilime doğru indirin ve yüzeyin hemen üzerinde durun.

İlgilenilen bir astrositi iyontoforez ile doldurmak için, dilim yüzeyinin 40 ila 50 mikrometre altında, yaklaşık 10 mikrometre çapında, uzun, oval şekilli somata ile astrositleri tanımlamak için kızılötesi diferansiyel girişim kontrastını kullanın.

Bu, piramidal hücre tabakasının hemen altındaki hipokampusun stratum radiatumudur. Dokuda hareket ederken kan damarlarını, nöronları, astrositleri ve diğer hücre tiplerini görebiliriz.

Bir astrosit seçildikten sonra, hücreyi görüş alanının merkezine taşıyın ve elektrot ucunu yavaşça dilimin içine indirin. Elektrot hücre gövdesi ile aynı düzlemde olana kadar doku boyunca gezinmek.

Astrositin hücre gövdesi açıkça görüldüğünde ve ana hatları çizildiğinde, elektrotu yavaşça ve nazikçe ileri doğru ilerletin, elektrotu uç hücrenin somasını kazığa oturtana kadar hareket ettirin.

Elektrotun soma içinde olup olmadığını not etmek için objektifin odağını yavaşça yukarı ve aşağı hareket ettirin. Elektrot ucu hücrenin içine girdikten sonra, akımı hücreye sürekli olarak atmak için stimülatörü 0,5 ila 1 voltta açın.

Konfokal mikroskobu kullanarak, hücrenin ayrıntılarını görselleştirmek için dijital yakınlaştırmayı artırarak hücre dolgusunu izleyin ve elektrotun ucunun hücre içinde gerektiği gibi görünür olduğundan emin olun.

Voltajı kapatmadan ve elektrot ucunu hücreden nazikçe çekmeden önce daha ince dallar ve işlemler tanımlanmış görünene kadar yaklaşık 15 dakika bekleyin.

Doldurulmuş hücreyi görüntülemek için, daha ince dalların ve işlemlerin 40x objektif altında tanımlanmış göründüğünden emin olmak için konfokal mikroskoptaki ayarı değiştirmeden önce hücrenin orijinal biçimine dönmesi için 15 ila 20 dakika bekleyin.

0,3 mikrometre adım boyutuna sahip bir z-yığını kurun ve görüntüleme sırasında hücreden sinyal gelmeyene kadar objektifi hareket ettirin. Ve bu adımı en üst olarak ayarlayın.

Ardından, sinyal kalmayana kadar hücreye odaklanarak hedefi aşağı hareket ettirin. Ve bu adımı en alt olarak ayarlayın.