Fare Embriyolarından Türetilen Ventral Orta Beyin Nöronlarında Kalsiyum Akışının Görselleştirilmesi

Fare embriyolarından elde edilen ventral orta beyin nöronlarının kültürüne sahip bir lamel alın.

Hücreler, bir kalsiyum indikatörünü ifade etmek için viral bir vektör ile enfekte edilir.

Lameli bir kayıt tamponu ile perfüze edilmiş bir konfokal mikroskobun kayıt odasına aktarın.

Görünür ışığı kullanarak, birden fazla nöron içeren bir bölgeyi belirleyin, ardından floresan görüntülemeye geçin.

Düşük hücre içi kalsiyum seviyelerinde, gösterge bağlanmadan kalır ve düşük floresan yoğunluğu sergiler.

Nöronların içsel özellikleri, voltaj kapılı kalsiyum kanallarının açılmasını ve kalsiyum akışına izin vermesini tetikleyen spontan aksiyon potansiyelleri üretir.

Fazla kalsiyum, indikatöre bağlanarak floresan yoğunluğunu artıran konformasyonel bir değişikliğe neden olur.

Spontan kalsiyum aktivitesini izlemek için zaman içindeki floresan yoğunluğunu kaydedin.

Nöronlar üzerindeki reseptörlere bağlanan ve sürekli aksiyon potansiyelleri üreten yüksek konsantrasyonda bir nörotransmitter tanıtın.

Sürekli voltaj kapılı kalsiyum kanalı aktivasyonu, kalsiyum akışını uzatarak floresan yoğunluğunda sürekli bir artışa neden olur.

El yazması talimatlarına göre 1 litre HEPES kayıt tamponu, 200 mililitre 20 mikromolar glutamat kayıt tamponu ve 200 mililitre 10 mikromolar NBQX kayıt tamponu hazırlayın. Steril bir milimetre Petri kabını 3 mililitre kayıt tamponu ile doldurun.

Enfekte kültürlerin bulunduğu Petri kabını inkübatörden alın, daha sonra ince uçlu forseps ile bir lamel kenarını dikkatlice tutun ve kayıt tamponu ile tabağa aktarın. Kalan lameli orta kısımda 37 santigrat derece inkübatöre geri yerleştirin ve tabağı kayıt tamponu ile konfokal mikroskoba taşıyın.

Görüntüleme yazılımını başlatın. Başlatılırken peristaltik pompayı çalıştırın ve hattı kayıt arabelleğine yerleştirin. Ardından akışı dakikada 2 mililitreye kalibre edin. Enfekte lamel peter kabından ince forseps ile kayıt banyosuna aktarın. 10x suya daldırma objektifini ve parlak alan ışığını kullanarak odak düzlemini bulun ve yüksek yoğunluklu nöron hücresi gövdelerine sahip bir bölge arayın. Ardından 40X objektife geçin ve örneği yeniden odaklayın.

Boyalar listesi penceresinde Alexa Flour 488'i seçin ve uygulayın. Floroforların aşırı maruz kalmasını ve foto-ağartılmasını önlemek için, düşük HV ve lazer gücü ayarlarıyla başlayın. Alexa Fluor 488 kanalı için HV'yi 500'e, kazancı 1x'e ve ofseti sıfıra ayarlayın. 488 lazer çizgisi için gücü %5'e ayarlayın, iğne deliği boyutunu 300 mikrometreye yükseltin ve emisyon sinyallerini alt doygunluk seviyelerine en iyi şekilde ayarlamak için odak x2 tarama seçeneğini kullanın.

Ayarlar daha sonra her kanalın optimum görünürlüğü için ayarlanabilir. Mikroskop ayarları optimize edildikten sonra, GCaMP6f floresansında spontan değişiklikler gösteren birden fazla hücrenin bulunduğu bir bölgeyi bulmak için sahneyi hareket ettirin ve görüntüleme için istenen düzleme odaklanın. Görüntüleme çerçevesini bir saniyenin biraz altında bir kare aralığı elde edebilecek bir boyuta kırpmak için klip düzeltme aracını kullanın. Aralık penceresini 1,0 değerine ve Num penceresini 600 değerine ayarlayın.

T serisi bir film çekmek için zaman seçeneğini seçin, ardından görüntülemeye başlamak için XYt tarama seçeneğini kullanın. Görüntüleme ilerleme çubuğunu izleyin ve hattı HEPES kayıt tamponundan uygun zaman noktasında 20 mikromolar glutamat kayıt tamponuna taşıyın. Görüntüleme tamamlandığında, dizi bitti düğmesini seçin ve bitmiş t serisi filmi kaydedin. Glutamat'ı beş dakika daha perfüze etmeye devam edin, böylece kültürlenmiş nöronlar toplam 10 dakika boyunca glutamata maruz kalır.

Görüntülenecek her lamel için bu işlemi tekrarlayın. Deneyin hemen ardından nöronal hücre gövdelerinde kalsiyum izlerini görmek mümkündür. Nöronal soma etrafında istenen sayıda ROI çizmek için elips aracını kullanın ve izleri görselleştirmek için seri analizi düğmesini kullanın. Glutamata beş dakika daha maruz kaldıktan sonra, lameli ince forseps ile banyodan çıkarın ve tüm görüntüleme tamamlanana kadar kayıt tamponu ile birlikte Petri kabına geri yerleştirin.