Kısa Süreli ve Uzun Süreli Sıçan Hipokampal Kültürlerinde İn Vitro Kalsiyum Görüntüleme

Genç nöronları temsil eden kısa süreli bir sıçan hipokampal nöronal kültürünü ve yaşlı nöronları temsil eden uzun süreli bir kültürü ele alalım.

Yaşlı nöronlar, membran depolarizasyonu üzerine daha uzun süre açık kalan L-tipi voltaj kapılı kalsiyum kanallarının veya L-VGCC'lerin daha yüksek bir yoğunluğunu sergiler.

Hücrelere yayılan bir floresan kalsiyum indikatörü ile inkübe edin, ardından fazla boyayı çıkarmak için yıkayın.

Kültürleri bir floresan mikroskobu altında bir perfüzyon odasına yerleştirin.

Nöronlar üzerindeki reseptörlere bağlanan, sodyum iyonlarının akışını indükleyen ve membran depolarizasyonunu tetikleyen nörotransmiterler içeren bir çözelti ekleyin.

Depolarizasyon, L-VGCC'leri aktive ederek sitoplazmaya kalsiyum akışını sağlar.

Uzun süreli kültürde, L-VGCC'lerin daha yüksek yoğunluğu ve uzun süreli açılması, nöronal yaşlanmanın ayırt edici bir özelliği olan kalsiyum aşırı yüklenmesine yol açar.

İndikatöre kalsiyum bağlanması, floresan üretir, yaşlı nöronlar daha yüksek floresan yoğunluğu sergiler ve stimülasyon üzerine artan hücre içi kalsiyum seviyelerini yansıtır.

Bu prosedürde, hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında 60 dakika boyunca Fura2-ile inkübe edin, ardından lamelleri perfüzyon odasına aktarın. Bundan sonra, perfüzyon odasını lamel ile birlikte ters çevrilmiş mikroskop üzerindeki tutucuya yerleştirin. Mikroskobik alanı seçin ve önceden ısıtılmış HBS ile hücreleri sürekli olarak perfüze edin.

Daha sonra, hücreleri nihayetinde 340 ve 380 nanometrede epi-aydınlatın, ardından her 5 ila 10 saniyede bir 520 nanometrede yayılan ışığı, bir Fura-2 dikroik ayna tarafından filtrelenen bir floresan kamera ile kaydedin. Kaydedilen floresan görüntüleri analiz etmek için. İlk olarak deney dosyasını açın.

AquaCosmos yazılımını kullanarak Oran'a tıklayın ve istediğiniz oran aralığını seçin. Bir dizi oran görüntüsü elde etmek için ortaya çıkan görüntülerde piksel piksel oranını hesaplayın. Ardından, arka plan aydınlatma düğmesini ayarlayarak arka planı çıkarın. Bundan sonra, Hesaplamayı Başlat'a basın. ardından, Tüm Zamanların Sırası düğmesine basın ve eski ROI'leri silin.

Tek tek hücrelerin kantitatif analizi için, tek tek nöronlara karşılık gelen yeni ROI'ler veya ROI'ler oluşturun. Tek tek kayıtların grafiğini çıkarmak için, Graph'a tıklayarak her bir ROI'ye karşılık gelen oran floresan değerlerini kaynak laboratuvar programına aktarın. Ardından Hesapla'ya tıklayın ve TXT dosyasını kaydedin. Bundan sonra, her bir stimülasyona yanıt olarak floresan oranındaki artışın boyutunu tahmin etmek için ilgili hesaplamayı yapın.