JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 3:14 dk • May 29th, 2025
Nörodejeneratif bir fare modelinden beyin bölümleriyle başlayın.
Doku geçirgenliğini artırmak ve spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için deterjan takviyeli bir engelleme solüsyonu ile inkübe edin. Çözümü atın.
Amiloid-beta plaklarını hedef alan primer antikorları tanıtın. Antikorların amiloid-beta plakları ile etkileşime girmesi için ajitasyon ile inkübe edin, ardından yıkayın.
Kırmızı florofor etiketli ikincil antikorlar ekleyin ve antikorların etkileşime girmesine izin vermek için karanlıkta inkübe edin.
Bağlanmamış antikorları çıkarmak için yıkayın, ardından alkolle yıkayın.
Beta yaprağı bakımından zengin amiloidleri yüksek afiniteye bağlayan kurkumin ekleyin, ardından yıkayın.
Daha sonra, artan alkol konsantrasyonları ile tedavi edin, beyin bölümlerini kurutun. Herhangi bir reaktif izini gidermek için ksilen ekleyin.
Bir slayt üzerine bir bölüm monte edin ve bir floresan mikroskobu altında gözlemleyin.
İkincil antikorlar üzerindeki kırmızı floroforları uyarmak için 590 nanometre dalga boyunda bir lazer kullanın. Görüntüyü yakalayın.
Yeşil floresan yayan kurkumini uyarmak için 480 nanometre dalga boyunda bir lazere geçin.
Görüntüleri üst üste bindirin; Kırmızı ve yeşil floresan kolokalizasyonu, beyin dokusundaki amiloid-beta plağını doğrular.
Kriyostat kesitli numunelerin anti-A beta antikorları ile etiketlenmesi için, PBS'de %10 normal keçi serumu ve oda sıcaklığında bir saat boyunca %0.5 Triton x-100 ile spesifik olmayan herhangi bir bağlanmayı bloke etmeden önce, numuneleri 12 oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarında yıkama başına üç kez taze PBS ile yıkayın.
İnkübasyonun sonunda, bloke edici çözeltiyi atın ve numuneleri gece boyunca 4 santigrat derecede ve dakikada 150 dönüşte A beta spesifik antikor ile inkübe edin. Ertesi sabah, bölümleri yıkama başına taze PBS'de 10 dakikalık üç yıkama ile yıkayın, ardından ışıktan korunan oda sıcaklığında bir saat boyunca kırmızı bir florofor ile konjuge edilmiş uygun bir ikincil antikor ile inkübe edin.
İnkübasyonun sonunda, bölümleri PBS ile üç kez yıkayın ve ardından% 70 alkol ile bir yıkama yapın. Alkollü yıkamadan sonra, bölümleri 10 mikromolar kurkumin ile oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin, ardından üç, bir dakikalık% 70 alkollü yıkama yapın.
Son yıkamadan sonra, bölümleri konsantrasyon başına bir dakika boyunca %90 ve %100 alkolle kurutun ve inkübasyon başına taze ksilen ile bölümleri daldırma başına beş dakika boyunca iki kez temizleyin. Ardından bölümleri gösterildiği gibi monte edin ve görüntüleyin.