Fare Beyin Dokusunda Kuduz Virüsü Enfeksiyonunun Üç Boyutlu Görüntülenmesi

Kuduz virüsü ile enfekte olmuş bir fareden sabit kalın bir beyin bölümü alın.

Virüs nöronları enfekte eder ve çoğalır, bu da hücrelerde bulunan viral proteinlerle sonuçlanır.

Hücresel zarları geçirgen hale getirmek için bir deterjan ve spesifik olmayan bağlanma bölgelerini maskelemek için bir engelleme solüsyonu ile muamele edin.

Viral proteinleri hedef alan birincil antikorlarla inkübe edin, ardından birincil antikorlara bağlanan florofor konjuge ikincil antikorlar gelir.

Çekirdeği etiketlemek için floresan nükleik asit bağlayıcı bir boya ile muamele edin.

Dokuyu artan alkol konsantrasyonlarında kurutun, ardından görüntüleme için doku şeffaflığını artırmak için bir temizleme solüsyonu uygulayın.

Bölümü bir görüntüleme odasına monte edin, temizleme solüsyonuyla doldurun ve kapatın.

Konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak, floresan etiketleri kullanarak dokuyu ayrı ayrı görüntüleyin, ardından iki boyutlu bir görüntü oluşturmak için bunları birleştirin.

Doku boyunca farklı odak düzlemlerinde görüntüler elde edin ve enfeksiyonun ilerlemesini değerlendirmek için üç boyutlu bir temsil oluşturmak üzere bunları birleştirin.

Beyin dokusu bölümlerinin immün boyaması için, numuneleri PBS'de 4 mililitre% 0.2 Triton X-100 içinde 1 saat boyunca iki kez yıkayın, ardından 37 santigrat derecede iki gün boyunca, 4 mililitre% 0.2 Triton X-100,% 20 dimetilsülfoksit ve PBS'de 0.3 molar glisin içinde geçirgenlik yapın. 37 santigrat derecede iki gün boyunca PBS'de 4 mililitre% 0.2 Triton X-100,% 10 dimetilsülfoksit ve% 6 normal serum ile spesifik olmayan bağlanmayı bloke edin.

Bloke edici inkübasyonun sonunda, numuneleri 37 santigrat derecede beş gün boyunca 2 mililitre birincil antikor çözeltisi ile etiketleyin ve antikor çözeltisini iki buçuk gün sonra yenileyin. Daha sonra, numuneleri bir gün boyunca PBS'de mililitre başına 4 mililitre% 0.2 Tween 20 ve 10 mikrogram heparin içinde yıkayın, yıkama tamponunu gün boyunca en az dört ila beş kez değiştirin ve son yıkamayı gece boyunca açık bırakın.

Ertesi gün, numuneleri 37 santigrat derecede beş gün boyunca 2 mililitre ikincil antikor çözeltisi içinde inkübe edin. Daha sonra, numuneleri gösterildiği gibi PBS'de 4 mililitre taze% 0.2 Tween 20 ve mililitre başına 10 mikrogram heparin içinde yıkayın.

Numunelerin nükleer olarak boyanması için, numuneleri 4 mililitre nükleik asit boyası TO-PRO-3 içinde ışıktan korunarak 5 saat inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, numuneleri gösterildiği gibi PBS'de mililitre heparin başına% 0.2 Tween 20 ve 10 mikrogram içinde yıkayın, ardından daldırma başına 2 saat boyunca artan bir tert-bütanol serisinde dehidrasyon yapın.

% 90 daldırmadan sonra, numuneleri gece boyunca% 96 tert-bütanol çözeltisine aktarın. Ertesi sabah, taze hazırlanmış BABB-D15'teki doku kesitlerini optik olarak şeffaf olana kadar 2 ila 6 saat temizlemeden önce numuneleri 2 saat boyunca %100 tert-butanol içinde daha fazla kurutun. Numuneler daha sonra BABB-D15'te, montajlarına ve görüntülemelerine kadar ışıktan korunarak saklanabilir.

Numune montajı için, bir görüntüleme odası ve kapak yazdırmak için bir 3D yazıcı kullanın. 30 milimetre çapında bir lamel tek bileşenli oda sıcaklığında vulkanize silikon kauçuk ile görüntüleme odasına monte edin. Benzer şekilde, kapağa 22 milimetrelik bir lamel monte edin. Kauçuğun gece boyunca kürlenmesine izin vermeden önce her iki halkadaki fazla silikon kauçuğu çıkarmak için suyla ıslatılmış bir pamuklu çubuk kullanın.

Ertesi gün, görüntüleme odasına bir numune yerleştirin ve kapağı yerleştirmeden önce hazneye küçük bir hacimde BABB-D15 ekleyin. Hipodermik bir iğne kullanarak, hazneyi girişten BABB-D15 ile doldurun ve görüntüleme haznesini silikon kauçukla kapatmadan önce girişi tıkayın.

Görüntü alımını ayarlamak için, kullanılan floroforlar için uygun lazer çizgilerini seçin ve kanallar arasında sinyal çakışmasını önlemek için her dedektörün algılama aralıklarını ayarlayın. Ardından alım parametrelerini ayarlayın, yığının üst ve alt kenarlığını tanımlayın ve görüntü yığınını alın.

Görüntü yığınının 3B projeksiyonlarını oluşturmak için, görüntü dosyalarını Fiji'de açın ve birleştirilmiş görüntüleri ayrı kanallara bölmek için Görüntü, Renk, Kanallar aracı, Daha Fazla ve Kanalları Böl'ü seçin. Her kanal için görüntülerin ağartma düzeltmesi için Görüntü, Ayarla, Ağartma Düzeltme'yi seçin ve Basit oran'ı seçin. Her kanalın parlaklığını ve kontrastını ayarlamak için kaydırıcıları kullanın ve Görüntü, Renk ve Kanalları Birleştir'i seçin. Seçeneği işaretleyin Kompozit oluştur.

Görüntüyü RGB formatına dönüştürün ve bir 3B projeksiyon oluşturmak için Görüntü, Yığınlar ve 3B proje'yi seçin. Projeksiyon yöntemi olarak en parlak noktayı seçin ve dilim aralığını, alınan görüntü yığınının Z adımı boyutuyla eşleşecek şekilde ayarlayın. Maksimum kalite için, dönüş açısı artışını 1 olarak ayarlayın ve enterpolasyonu etkinleştirin. Toplam döndürme, Saydamlık eşikleri ve Opaklık'ı gerektiği gibi değiştirin. Ardından 3D projeksiyonu her ikisi olarak da kaydedin. TIFF ve .AVI dosya biçimleri.