Sabit Bir Fare Beyin Diliminde Miyelinli Akson Çaplarını Belirlemek için Spektral Reflektometri Kullanma

Beyin dokusu miyelin kılıf nanoyapısını çözmek için geniş bir spektral aralık için yapılandırılmış stabilize bir lazer kaynağına sahip bir hiperspektral konfokal mikroskop alın.

Temel yansıma spektrumunu yakalamak için bir referans aynası kullanın. Aynayı çıkarın ve dedektör gürültü düzeltmesi için karanlık bir ofset spektrumu elde edin.

Sabit bir beyin dokusu kesiti olan bir odayı mikroskop aşamasına aktarın.

Odak düzlemini ilgilenilen doku bölgesine hizalayın ve cam-doku arayüzünden gelen paraziti en aza indirmek için yeterli derinliği sağlayın.

Lazer ışığı, aksonların çok katmanlı miyelin kılıfına yönlendirilir.

Işık miyelin ile etkileşime girdiğinde, katmanların arayüzlerinde kısmi yansımalar meydana gelir ve değişen katman kalınlıkları ve kırılma indisleri nedeniyle girişim desenleri üretir.

Bu girişim modellerinin spektral görüntülerini elde edin.

Temel düzeltme ve sinyal analizinden sonra, yansıma spektrumu, miyelinli akson çaplarının belirlenmesine izin veren dalga sayısı periyodikliğini ortaya çıkarır.

Mikroskop aşamasına, yüzeyi objektif merceğe bakacak şekilde bir referans aynası monte edin. Aynayı mikroskop tablasına koymak kolay değilse, düz plakaya bir ayna yapıştırın. Odak düzlemini ayna yüzeyine hizalamak için mikroskop aşamasını ayarlayın. Ardından, dedektörün dinamik aralığını göz önünde bulundurarak PMT kazancını ve lazer gücünü ayarlayın.

Sahte bir renk altında, dalga boyu aralığı boyunca doygunluk olmadığını kontrol edin. Doygunluk gözlenirse, lazer gücünü düşürün. Ardından, lambda taraması alımını çalıştırın. Aynayı sahneden çıkarın ve karanlık referansı elde etmek için aynı alımı numune olmadan tekrarlayın. Ardından, verileri çok yığınlı bir TIFF biçiminde kaydedin.

SpeRe görüntü alımını gerçekleştirmek için, monte edilen dokuyu mikroskop tablasına yerleştirin. Dokuyu bir göz merceği aracılığıyla objektif merceğin odak düzlemine kabaca hizalamak için geniş alanlı floresan modunu kullanın. Canlı tarama açıkken, odak düzlemini dokudaki ilgili bölgeye hizalamak için mikroskop aşamasını kontrol edin. Lameli arka plan gürültüsünü önlemek için, cam doku arayüzünden en az 15 mikrometre derinliğinde bir hedef bölge seçin.

Bu videoda daha önce gösterildiği gibi aynı yordamı kullanarak hedef bölge için spektral görüntü yığınını alın. Ardından, doku ve koyu ofset için verileri çok yığınlı TIFF formatında kaydedin. ImageJ'deki görüntüleri işlemek için referans ayna ve beyin dokusu için spektral verileri açın.

Açılan görüntü yığınları için ROI'leri, referans aynası için merkezi alanı ve beyin dokusu için bir akson lifinin segmentini seçin. Ardından, seçilen ROI'ler için ham spektrumları elde etmek için görüntüyü, yığınları, çizimleri z ekseni profilini çalıştırın.

Akson lifleri, uzunlukları boyunca yapısal olarak heterojen olabilir, bu nedenle, kısmi hacim artefaktlarını en aza indirmek için tipik olarak 5 mikrometreden daha küçük olan küçük bir akson segmentinde ROI'nin seçilmesi önerilir.

Biri referans aynası için, diğeri beyin dokusu için alınan koyu ofset verilerini açın ve z ekseni profilini az önce gösterildiği gibi çizin. Ardından, alınan tüm seçenekleri kaydetmek için kopyala ve yapıştır seçeneklerini kullanın.