Işık Tabakası Floresan Mikroskobu Kullanılarak Motor Nöron Projeksiyonlarının ve Akson Dallanmasının Görselleştirilmesi

Spinal motor nöronlarda yeşil floresan proteini (GFP) eksprese eden transgenik bir fare embriyosundan kimyasal olarak sabitlenmiş ve temizlenmiş bir doku segmenti alın.

Dokuyu modifiye edilmiş bir pipet ucuna dikey olarak monte edin.

Ucu, ışık tabakası floresan mikroskobu içinde sabitlenmiş bir kılcal damara takın.

Dokuyu daldırmak ve kalıntıları temizlemek için dokunun altına tampon dolu bir numune odası yerleştirin.

Görüntüleme yazılımını kullanarak, dokuyu ışık yolunda hizalayın.

Görüntü alımına başlayın.

Işık kaynağı, floresan yaymak için dokunun tek bir düzleminde GFP'leri uyaran ince bir lazer ışığı tabakası yayar.

Işık yoluna dik olarak yerleştirilmiş bir dedektör, yayılan floresansı yakalar.

Aksonal dallanma morfolojisinin 3 boyutlu bir rekonstrüksiyonunu oluşturmak için spinal motor nöronların görüntülerini elde edin.

Aksonları haritalamak, motor nöron büyümesini ve bağlantısını değerlendirmek için dallanma modellerini ve uç noktaları belirlemek için yazılım kullanın.

5X/0.1 aydınlatma optiği ve 5X/0.16 algılama optiği ayarlayın. Numune tutucuyu ve numune kılcalını monte edin. Numune haznesini temizleme solüsyonu ile doldurarak hazırlayın. Embriyoyu monte etmek için, üst kısmı kılcal damarın çapına uyacak şekilde keserek bir P200 pipet ucu hazırlayın ve numune eki için sivri kısmı çıkarın.

Ardından, pipet ucunun körelmiş ucunu küçük bir alev kullanarak eritin. Alevi söndürün ve embriyoyu erimiş uca dikey olarak hızlı bir şekilde tutturun. Pipet ucunun üst kısmını numune kılcal damarı ile takın ve hazırlanan numune haznesini mikroskoba koyun. Görüntüleme yazılımını kullanarak, Locate (Bul) sekmesi altında Locate Capillary (Kılcal Damarları Bul) öğesini seçin ve xy ve z eksenlerini ayarlayın.

Ardından, Örneği Bul'u seçin ve embriyoya odaklanmak için 0,6X'e yakınlaştırın. Herhangi bir kalıntı veya kabarcıkları temizlemek için oda tamponunun bir süre embriyo ile dengelenmesine izin verin. Edinme sekmesi altında görüntü alımı için, algılama hedefleri, lazer engelleme filtresi, ışın ayırıcı, kameralar ve lazerler gibi ışık yolu parametrelerini tanımlayın.

Gölge azaltma için pivot tarama onay kutusunu işaretleyin. Ardından, edinme ayarlarını, bit derinliğini 16 bit olarak tanımlayın. 0,36 ile 0,7X tek taraflı aydınlatma veya çift taraflı aydınlatma aralığına yakınlaştırın. Devam'ı tıklatın ve lazer yoğunluğunu, pozlama süresini, lazer gücünü ve ışık tabakası konumunu ayarlayın. Ardından, görüntü alımını sonlandırmak için durdur'a basın.

Bireysel motor sinirler üzerindeki ince dik yapıların görüntülerinin ayrıntılı olarak elde edilmesini sağlamak için şeffaf numunenin en kısa ışık yolu içinde konumlandırıldığından emin olmak önemlidir.

Çok boyutlu alım için, ilk ve son görüntü için Z konumunu hareket ettirerek Z yığınını tanımlayın. Dilim numarasını ayarlamak için En İyi'yi tıklatın. Ardından, seçili Z yığınını almak için Denemeyi Başlat'a tıklayın. Tamamlandığında, görüntüyü nokta CZI formatında kaydedin.

Akson arborizasyonunu ölçmek için, görüntü dosyasını görüntüleme analiz yazılımında açın. Yerel yoğunluk kontrastına dayalı olarak filamentleri algılamak için ekran ayarlama penceresini kullanarak görüntü rengini, parlaklığını ve kontrastını ayarlayın. Ardından, Yeni Filament Ekle simgesine tıklayın ve açılır menüden otomatik yol algoritmasını seçin. İlgilendiğiniz bölgeyi seçin.

Ardından, dilim modu kullanılarak ölçülebilen en büyük ve en ince çap ölçümlerini atayarak başlangıç ve tohum noktalarını tanımlayın. İlgilenilen bölgenin kenarına bir başlangıç noktası atayın. Başlangıç noktalarının el ile eklenmesini veya kaldırılmasını sağlamak için, önce işaretçi modunu değiştirin, Seçim'de Gezinin ve ardından ilgi noktalarını kaydırıp sağ tıklatın.

Ardından, tüm görünür ağaç iptallerinin işaretlendiğinden emin olmak için Tohum Noktaları İçin Manuel Eşikler'i seçin. Ardından, tohum noktalarını manuel olarak ekleyin veya kaldırın. Bağlantısı Kesilmiş Segmentleri Kaldır kutusunu işaretleyin ve başlangıç noktalarının etrafındaki çekirdek noktaları kaldırın. Ardından, Arka Plan Çıkarma Eşiğini ayarlayın ve işlemi bitirin.

Doğru niceleme için arka plan artefaktlarını kaldırmak ve dedektör yolunun gerçek akson arborizasyonunu yansıttığını doğrulamak gerekir.

Sonunda, istediğiniz stili ve rengi seçin. İstatistikler sekmesi altında, ayrıntılı seçeneğini seçin ve motor akson arborizasyonunun bir göstergesi olarak motor sinir terminallerini ölçmek için filament sayısı dendrit terminal noktalarını kullanın. Ardından, yeniden yapılandırılmış aksonun görüntüsünü bir . TIFF dosyası.