JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 3:34 dk • May 29th, 2025
Düzleştirilmiş beyin kortikal bölümlerinin önceden sabitlenmiş teğetsel bölümleriyle başlayın. Fiksatif izleri gidermek için yıkayın.
Bölümleri bir diaminobenzidin veya DAB çözeltisi ve nikel-amonyum sülfat ile boyayın.
DAB kortikal nöronlara yayılır ve mitokondrideki sitokrom oksidaz ile reaksiyona girerek koyu renkli bir çökelti oluşturur. Nikel-amonyum sülfat çökeltiyi koyulaştırarak kontrastı arttırır.
Lekelenme reaksiyonunu durdurmak için paraformaldehit ekleyin, ardından durulayın.
Bölümleri bir slayt üzerine monte edin ve etanol yıkamaları ile kurutun.
Bölümü temizlemek ve ışık iletimini iyileştirmek için izopropanol ve ksilen ile durulayın.
Bir montaj ortamı uygulayın ve üzerine bir lamel koyun.
Parlak alan mikroskobu altında, kortikal nöronlar içinde görüntülendiğinde, çökeltiler ışığı emer ve saçar, bu da karanlık görünmelerini sağlar.
Buna karşılık, lekelenmemiş, temizlenmiş alanlar ışığı iletir ve parlak görünür.
Bu kontrast, kortikal modülleri, duyusal bilgilerin işlenmesinde yer alan aktif nöral kümeleri temsil eden, daha açık bir arka plana karşı koyu, yamalı yapılar olarak vurgular.
Kesit dokusunu HEPES tamponunda 15 dakika boyunca hafif çalkalayarak yıkayın. Yıkama sırasında taze sitokrom oksidaz boyama solüsyonu hazırlayın ve kullanmadan hemen önce DAB bileşenini ekleyin. Şimdi, taze yapılmış boyama solüsyonundaki bölümleri oda sıcaklığında çalkalayıcı ile inkübe edin. Ve izlemeye devam et. Fiksasyon miktarına bağlı olarak, lekelenme 10 dakika içinde gözlenebilir veya birkaç saat sürebilir.
Reaksiyon çok yavaş gidiyorsa, sıcaklığı 37 santigrat dereceye yükseltin. Reaksiyonu durdurmak için, bölümleri %4 PFA'lık bir banyoya aktarın ve hafif çalkalama ile 15 dakika inkübe etmelerine izin verin. Ardından, bölümleri yıkama başına 10 dakika boyunca HEPES tamponu ile üç kez yıkayın.
Şimdi, bölümleri cam slaytlara monte edin ve kurutun ve giderek daha güçlü etanol banyoları kullanarak kurutun. Ardından, slaytları izopropanol içinde 5 dakika, ardından beş dakika ksilen ile yıkayın. Ksilen banyosundan sonra, hemen hızlı sertleşen su bazlı olmayan bir montaj ortamı ekleyin. Su bazlı ortamlar lekeyi bozar. Bir lamel ekledikten sonra, slaytları görüntülenene kadar 4 santigrat derecede saklayın.