JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 4:38 dk • May 29th, 2025
Fare siyatik sinirlerinden ve dorsal kök gangliyonlarından veya DRG'lerinden izole edilmiş hücreleri alın.
Bağışıklık hücrelerini etiketlemek için CD45 ve CD11b'ye karşı florofor etiketli antikorlarla ve MHC sınıf II'ye karşı biyotin etiketli antikorlarla inkübe edin.
Biotin'e bağlanan florofor etiketli streptavidin ile inkübe edin.
Hücresel yapıyı stabilize etmek için bir fiksatif ile tedavi edin.
Membranları geçirgen hale getirmek ve çekirdekleri etiketlemek için floresan DNA boyası ile bir geçirgenlik tamponu ekleyin.
Bir akış sitometresi kullanarak, optik ve floresan özelliklerini değerlendirmek için hücreleri lazer ışınından geçirin.
Tek hücreleri izole etmek ve işaretleyicilerden floresanı tespit etmek için daha yüksek DNA floresansına sahip agregaları çıkarın.
Bağışıklık hücrelerinin karakteristik bir belirteci olan CD45'i eksprese eden hücreleri tanımlayın ve varlıklarını doğrulayın.
DRG'deki çoğu CD45 pozitif hücre, siyatik sinirlerde bulunmayan mikroglia benzeri hücreleri gösteren CD11b ve MHC sınıf II'yi eksprese eder.
Bu teknik, sinir dokuları içindeki bağışıklık hücresi heterojenliğini analiz etmek için görüntülemeyi tamamlar.
Bilgisayarda, ilgilenilen floroforların tespiti için uygun kanalları, numuneler için uygun akış hızını ve numune başına toplanacak toplam olay sayısını seçin. Minimum etkinlik sayısı 1 milyon olmalıdır.
Daha sonra, yan saçılma A'ya karşı yan saçılma A'nın genel bir çalışma sayfası altında ve ayrıca ilgilenilen her florofor ile ileri saçılma A'nın genel çalışma sayfası altında dağılım grafikleri oluşturun. Ayrıca, seçilen floroforlar için olay sayısını ve ortalama floresan yoğunluğunu görüntüleyecek istatistiksel bir görünüm oluşturun.
Yalnızca DAPI boyama kontrollerinden gelen dağılım grafiğine dayalı olarak üst kapı P1'i belirleyin. Örneği akış sitometrisine ekleyin ve Al'a tıklayın. DAPI'ye karşı FSC grafiğini gözlemleyin ve DAPI-plus popülasyonu görünür hale gelene kadar DNA Pasifik Mavisi kanalının voltajını azaltın. Dikdörtgen geçit aracını kullanarak, DAPI-plus popülasyonunun etrafına bir kutu çizin. Bu, P1 kapısını temsil eder. Floroforların her biri için dağılım grafiklerini seçin ve yalnızca DAPI-plus olaylarını görüntüleyin. Bu, floroforların her biri için arka plan floresansını temsil eder.
Dikdörtgen geçit aracını kullanarak, floroforların her biri için dağılım grafiklerinde y ekseninde 103'ten başlayarak bir kutu çizin. Bu kapı, belirtilen belirteçlerin her biri için olumlu olayların bulunması gereken bölgeyi temsil eder. Yalnızca DAPI boyama kontrollerini kullanarak floroforların her biri için voltajları ayarlayın. Örneği akış sitometrisine ekleyin ve Al'a tıklayın.
Floroforların her biri için DAPI-plus popülasyonunun konumunu gözlemleyin ve ilgili voltajları, popülasyonlar dikdörtgen kapının dışına çıkacak şekilde ayarlayın. Akış sitometresi kurulduktan sonra, numuneleri çalıştırın ve daha fazla analiz için ileri saçılma dosyalarını dışa aktarın.