Farklılaşmış Oligodendrositleri Tanımlamak için Çift Floresan Görüntüleme

Bir sıçan yavrusu beyninden izole edilen ve oligodendrositlere farklılaşmak için indüklenmiş bir oligodendrosit öncü hücre (OPC) kültürünü ele alalım. Hücreler, hücresel mimariyi korumak için sabitlenir.

Diferansiye oligodendrositler, olgun oligodendrositlerin bir belirteci olan miyelin bazik proteinini veya MBP'yi eksprese ederken, hem OPC'ler hem de farklılaşmış hücreler oligodendrosit transkripsiyon faktörü 2'yi veya Olig2'yi eksprese eder.

Bir geçirgenlik bloke edici çözelti uygulayın ve çalkalama ile inkübe edin, hücresel zarları geçirgen hale getirin ve spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke edin.

Belirteçleri hedefleyen birincil antikorları ekleyin ve bağlanmaya izin vermek için çalkalama ile inkübe edin.

Bağlanmamış antikorları çıkarmak için yıkayın, daha sonra birincil antikorlara özgü farklı florofor konjuge ikincil antikorları ekleyin ve ajitasyon ile inkübe edin.

Hücreleri yıkayın, ardından çift floresan görüntüleme sistemine yerleştirin.

Farklı floroforları uyarmak için belirli dalga boylarındaki ışığı kullanın ve işaretçileri görselleştirmek için yayılan sinyalleri tespit edin.

Sadece olig2 ifade eden farklılaşmamış OPC'ler arasında olig2 ve MBP'yi ifade eden farklılaşmış oligodendrositleri tanımlayın.

Plakayı oda sıcaklığına getirin. Kuyuları aspire edin ve% 5 NGS ve% 0.1 Triton X-100 içeren 250 mikrolitre DPBS ekleyin. Plakayı hafif yörünge sallama ile bir saat oda sıcaklığında inkübe edin. % 5 NGS içeren DPBS'de fare monoklonal anti-MBP antikoru ve tavşan poliklonal anti-OLIG2 antikorunu seyrelterek birincil inkübasyon çözeltisini hazırlayın. Daha sonra, birincil antikorları gece boyunca 4 santigrat derecede 16 ila 18 saat boyunca hafif yörünge çalkalama ile inkübe edin.

Plakayı yıkarken, anti-mouse 680 ve anti-rabbit 800 antikorlarını %5 NGS içeren DPBS'de seyrelterek ikincil inkübasyon solüsyonunu hazırlayın. Ardından, son yıkamayı aspire edin ve 250 mikrolitre ikincil inkübasyon çözeltisi ekleyin. Plakayı ışıktan koruyun ve hafif yörünge sallama ile bir saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.

Bundan sonra, 700 nanometre ve 800 nanometre floresan emisyonlarını tespit edebilen bir görüntüleme sistemi kullanarak plakayı tarayın. Başlangıç noktası olarak, odak ofsetini 3'e ve hassasiyetleri MBP için 1.5'e, aktin için 5.0'a ve OLIG2 için 3.5'e ayarlayın. Sinyalin aşırı maruz kalmasını önlemek için hassasiyet değerlerini gerektiği gibi ayarlayın.